5-氮-2′-脫氧胞苷誘導(dǎo)膀胱癌ej細(xì)胞凋亡研究

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1、5-氮-2′-脫氧胞苷誘導(dǎo)膀胱癌EJ細(xì)胞凋亡研究【摘要】　?。勰康模萏接?-氮-2′-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）誘導(dǎo)膀胱癌EJ細(xì)胞凋亡機(jī)制。［方法］以不同濃度的5-Aza-CdR作用于膀胱癌EJ細(xì)胞，以四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞的增殖程度，原位凋亡細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)(TUNEL)和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)5-Aza-CdR對(duì)膀胱癌EJ細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。［結(jié)果］EJ細(xì)胞加入不同濃度的5-Aza-CdR（0.625，1.25，2.50，5.00mg/ml），與對(duì)照組相比各組EJ細(xì)胞增長(zhǎng)速度減慢。與對(duì)照組相比，不同濃度的各組5-Aza-CdR（0.625，1.25，2.

2、50，5.00mg/ml）可以顯著降低EJ細(xì)胞的增殖比和增高EJ細(xì)胞的凋亡指數(shù)(P<0.05)，且與5-Aza-CdR呈濃度依賴關(guān)系(P<0.05)；不同濃度的5-Aza-CdR作用EJ細(xì)胞后G0/G1期細(xì)胞明顯增加(P<0.05)。［結(jié)論］5-氮-2′-脫氧胞苷誘導(dǎo)膀胱癌EJ細(xì)胞凋亡并使EJ細(xì)胞阻滯于G0/G1期，從而抑制膀胱癌EJ細(xì)胞的增殖?！娟P(guān)鍵詞】5-氮-2′-脫氧胞苷　膀胱腫瘤　凋亡　　StudyonEJCells’ApoptosisInducedby5-Aza-2′-decxycytidine（5-Aza-CdR）5-氮-2′-脫氧胞苷（5-Aza

3、-2′-decxycytidine，5-Aza-CdR）是一種特異性甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，通過(guò)去甲基化作用可使多種CpG9島高甲基化的抑癌基因重新表達(dá)，恢復(fù)抑癌功能。但5-氮-2′-脫氧胞苷是否可以通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡達(dá)到治療腫瘤尚少見(jiàn)報(bào)道。本研究以膀胱癌EJ細(xì)胞株為研究對(duì)象，以不同濃度的5-Aza-CdR作用于EJ細(xì)胞，觀察5-Aza-CdR對(duì)EJ細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響，為膀胱癌的治療提供新的線索。1材料與方法1.1材料膀胱癌細(xì)胞株EJ細(xì)胞購(gòu)自北京大學(xué)泌尿外科研究所。5-Aza-CdR購(gòu)自Sigma公司；PRMI1640培養(yǎng)基、新生牛血清購(gòu)自GIBCO公司；原位凋亡細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)

4、（TdT-mediateddUTPnick-endlabeling，TUNEL）試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司。其它試劑均為分析純。1.2實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)：將復(fù)蘇的EJ細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基中，37°C，100%濕度，5%CO2，95%空氣，每24h換液1次。四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞增殖程度:9將培養(yǎng)的EJ細(xì)胞按隨機(jī)原則分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到亞融合狀態(tài)時(shí)，常規(guī)制成單細(xì)胞懸液，以5000個(gè)/孔將細(xì)胞接種于96孔板，每組4個(gè)平行孔。培養(yǎng)24h后，4℃冰箱2h，使細(xì)胞同步化。棄去培養(yǎng)液每孔按分組要求分別加入不同量的5-Aza-CdR(1mg/

5、ml)及無(wú)血清培養(yǎng)液，使各孔的終體積均為200μl，各組5-Aza-CdR的終濃度分別為0、0.625、1.25、2.5及5mg/ml,每一濃度重復(fù)4孔。37℃,5%CO2，培養(yǎng)48h后棄去培養(yǎng)液，各孔加入MTT20μl(5mg/ml)，37℃孵箱4h；各孔加入二甲基亞砜150μl，避光振蕩10min，酶標(biāo)儀640nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光值，以增殖比（proliferationratio）表示增殖程度（增殖比=實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值×100%）。原位凋亡細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：采用六孔板蓋玻片培養(yǎng)法，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104/孔，培養(yǎng)24h后，吸棄培養(yǎng)液，每孔按分組要求分別加

6、入不同量的5-Aza-CdR和無(wú)血清培養(yǎng)液，使各孔的終體積均為2ml，每組4個(gè)平行孔，各組5-Aza-CdR的終濃度分別為0、0.625、1.25、2.5及5mg/ml。37℃，5%CO2，培養(yǎng)48h后，以4%多聚甲醛固定，按原位凋亡細(xì)胞檢測(cè)試劑盒中說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，細(xì)胞核呈棕黃色染色判定為凋亡細(xì)胞。光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞。凋亡指數(shù)（apoptoticindex，AI）=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。流式細(xì)胞術(shù)（flow9cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)相變化：用培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞，按照隨機(jī)分組原則，將培養(yǎng)的細(xì)胞分為5組：空白對(duì)照組加入2ml無(wú)血清培養(yǎng)

7、液，另4組加入2ml5-Aza-CdR(1mg/ml)，每組4個(gè)平行孔，各組5-Aza-CdR的終濃度分別為0、0.625、1.25、2.5及5mg/ml。細(xì)胞經(jīng)24h培養(yǎng)后，胰酶消化，70%冷乙醇固定，碘化丙啶(PI)避光染色，用FACSort型流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期的分析。1.3統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差分析組間差異（t檢驗(yàn)）。2結(jié)果2.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖程度5-Aza-CdR對(duì)EJ細(xì)胞的增殖有抑制作用，加入5-Aza-CdR后，與空白對(duì)照組相比，不同濃度5