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1、大腸桿菌Mn-SOD基因的克隆及表達(dá)作者：李佩珍，張洪勤，應(yīng)俊，李東【摘要】目的:實(shí)現(xiàn)Mn-SOD基因在大腸桿菌（E.coli）中的可溶性表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行活性測定。方法：用PCR方法從大腸桿菌2號(hào)基因組中擴(kuò)增Mn-SOD基因編碼區(qū)，克隆到pUCm-TVector，測定核苷酸序列；再將基因編碼區(qū)克隆到原核表達(dá)載體PET-28a，構(gòu)建含Mn-SOD基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果：SDS-PAGE分析表明SOD的表達(dá)量約為細(xì)菌總蛋白的50%；黃嘌呤氧化酶法測定表達(dá)蛋白活性，菌體可溶性總蛋白中表達(dá)產(chǎn)物酶比活為3921.8U/
2、mg，是對(duì)照BL21的276.8倍。結(jié)論：Mn-SOD基因可在BL21中成功表達(dá)，產(chǎn)物具有高可溶性、高活性的特點(diǎn)。【關(guān)鍵詞】大腸桿菌；Mn-SOD；原核表達(dá)；活性測定Abstract:Objective:ToachievethesolubleexpressionofMn-SODgeneinE.coliandassaytheenzymeactivityoftheexpressedproduct.Methods:ThecodingregionofsuperoxidedismutasewasamplifiedusingPCRmethodfromtheE.coligen
3、ome.ThePCRproductwasclonedintoPUC19-Tvectorandsequenced.Inaddition，theclonedcodingregionofMn-SODwasinsertedintotheexpressionvectorPET-28atoformtherecombinantplasmid10PET-28a-Mn-SODandwasthentransformedintoE.coliBL21forexpression.Results:TheSDS-PAGEanalysisrevealedthattheexpressionrec
4、ombinantSODaccumulatedupto50%ofthetotalbacterialprotein.TheenzymeactivityofMn-SODwasassayedwithxanthineoxidasemethod.Theresultshowedthatthespecificactivityoftheexpressedproductinthetotalsolubleproteinwas3921.77U/mg，andwas276.77timesof.E.coliBL21.Conclusion：Mn-SODgenecanbesuccessfully
5、expressedinE.coliproductshatethechardcteristicsofhighsolubihityardhighactivity.Keywords:E.coli；Mn-SOD；prokaryoticexpression；enzymeactivity超氧化物歧化酶(superoxide10dismutase，SOD)是細(xì)胞體內(nèi)歧化超氧陰離子自由基(O-2)的一個(gè)抗氧化酶，按其結(jié)合的金屬性離子根據(jù)其中金屬輔基的不同可分為4類：Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD和Ni-SOD，它們通過催化超氧陰離子自由基0-2發(fā)生歧化反應(yīng)，達(dá)到
6、清除O-2的效果，具有防御氧毒性、增強(qiáng)機(jī)體抗輻射損傷能力、防衰老以及治療某些腫瘤、炎癥、自身免疫疾病等功效，廣受國內(nèi)外科研工作者的關(guān)注和重視[1]。通過轉(zhuǎn)SOD基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)SOD的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。本研究運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)大腸桿菌Mn-SOD基因的全長編碼序列進(jìn)行克隆，采用原核表達(dá)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)，應(yīng)用SOD酶活測定進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的酶活鑒定，成功地實(shí)現(xiàn)了Mn-SOD基因的克隆和表達(dá)，為該基因的下一步研究和應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。1材料和方法1.1質(zhì)粒及菌種E.coliJM109、E.coliBL21、PET-28a為本實(shí)驗(yàn)室保存；PUCm-T
7、載體購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。1.2試劑各種限制性內(nèi)切酶，T4DNALigase、RNAase、溶菌酶購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，100bpMarker購自北京晶美生物工程有限公司，DNA片段回收試劑盒(UNlQ-10Kit)、質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，超氧化物歧化酶測試盒購自南京建成生物工程研究所。1.3引物設(shè)計(jì)從Genbank中找到大腸桿菌Mn-SOD基因全長序列，用Primer3.0軟件設(shè)計(jì)引物：上游引物序列為5’-TGTGAATTCTATACCCTGCCATCCCTG-3’，下游引物序列為：5’-AGTAA
8、GCTTGCAGGCGG
