家蠅幼蟲防御素基因的克隆和序列分析

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1、家蠅幼蟲防御素基因的克隆和序列分析【摘要】目的：克隆家蠅幼蟲防御素（defensin）基因并進(jìn)行序列分析。方法：根據(jù)Genbank公布的家蠅成蟲defensin基因序列設(shè)計(jì)一對引物，以家蠅幼蟲基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序，并利用軟件進(jìn)行序列分析。結(jié)果：克隆得到的defensin基因的長度為330bp，編碼92個(gè)氨基酸，4個(gè)陽性克隆的DNA序列編碼的多肽在第27位氨基酸殘基不同，為K或N。結(jié)論：從家蠅幼蟲基因組DNA中克隆得到了defensin基因，發(fā)現(xiàn)了兩種相差一個(gè)氨基酸殘基的defensin前體蛋白，并初步預(yù)

2、測了兩種前體蛋白的化學(xué)性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，為該基因的重組表達(dá)奠定了基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】防御素類；家蠅；幼蟲；克隆，生物；序列分析　?。跘bstract］Objective:ToclonethedefensingenesofMuscadomesticalarvaeandanalyzetheirsequences．Methods:PCRwascarriedouttoobtainthegenefragmentwiththegenomicDNAofM.domesticalarvaeastemplate,andtheprimersusedw

3、eredesignedfollowingM.domesticaadultdefensingenesequenceinGenbank.ThePCRproductswerepurifiedandclonedintoplasmidTvector,andsequenced.Results:Theamplifiedproductswereabout330bp,andwerededucedtoencode92aminoacids.FiveSingleNucleotidedifferencesofsequencesexitedamon

4、gfour10clones.TwokindsofdeducedaminoacidsequencesofdefensingeneweregainedfromM.domesticalarvaeinthisexperiment.Conclusion:DefensingeneofM.domesticalarvaehasbeenclonedsuccessfully.Twokindsofdefensinprecursorproteinswerefound,whichlaysfoundationforfurtherresearchonr

5、ecombinantdefensinexpressionanditsantibioticactivety.　?。跭eywords］defensins；houseflies;larva;cloning,organism;sequenceanalysis濫用抗生素帶來了日益嚴(yán)重的微生物對抗生素的耐藥性問題，因此發(fā)現(xiàn)和篩選具有新的作用機(jī)理的抗菌藥物已經(jīng)成為當(dāng)前醫(yī)藥研究領(lǐng)域的迫切任務(wù)。昆蟲抗菌肽是一類生物活性小分子肽，具有熱穩(wěn)定性強(qiáng)、殺菌力強(qiáng)、抗菌譜廣和無免疫原性的特點(diǎn)，可以抑殺某些真菌、細(xì)菌、病毒及原蟲，并對多種癌細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)體

6、瘤有明顯的殺傷作用,且不會(huì)破壞正常細(xì)胞[1，2]，其突出的優(yōu)勢在醫(yī)藥領(lǐng)域展示出良好的應(yīng)用前景，將成為新一代的抗菌、抗病毒、抗癌藥物。家蠅(Musca10domestica)與其他昆蟲相比對病原微生物有著更為強(qiáng)大的免疫力，大量的研究結(jié)果顯示家蠅的強(qiáng)大免疫力正是因?yàn)轶w內(nèi)存在著抗菌[3]、抗病毒[4]、抗真菌[5]的活性分子。防御素（defensin）是抗菌肽家族中最為普遍的一類，并且在不同物種中有很高的保守性，具有廣譜的抗菌和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)的作用。由于天然抗菌肽的來源少，純化工藝的難度與高成本，無法滿足臨床試用和基礎(chǔ)研究的需

7、要。因此，通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)防御素，無疑是降低成本和大量生產(chǎn)的有效途徑。近年來，王來城[6]和許琴英[7]分別通過構(gòu)建cDNA文庫先后克隆了廣東家蠅幼蟲和山東家蠅成蟲的defensin基因，家蠅防御素在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達(dá)也獲得了初步成功[8，9]；王婷婷等[10]構(gòu)建了有利于家蠅defensin基因高效表達(dá)的同向串聯(lián)表達(dá)載體。在這些研究中，家蠅防御素基因的獲得均是通過從抽提家蠅RNA或是建立的cDNA文庫中來擴(kuò)增該基因，目前尚未見從家蠅基因組中克隆defensin基因的報(bào)道。本研究以貴州貴陽的家蠅幼蟲作為實(shí)驗(yàn)材料

8、，直接抽提幼蟲基因組DNA，用PCR方法克隆defensin基因，并與其cDNA相比較，了解其基因結(jié)構(gòu)，為下一步建立該基因高效穩(wěn)定的表達(dá)體系奠定基礎(chǔ)?！　?材料與方法　　1.1材料　　1.1.1家蠅幼蟲來源　　由貴陽醫(yī)學(xué)院昆蟲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供?！　?.1.2E．coliJM109菌株10　　本實(shí)驗(yàn)室