卷柏活性部位對胰島素抵抗大鼠肝臟胰島素受體mrna表達的影響

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1、卷柏活性部位對胰島素抵抗大鼠肝臟胰島素受體mRNA表達的影響作者：付雪艷，董琳，馬學(xué)琴，張義偉，武建軍【摘要】目的探討卷柏對胰島素抵抗大鼠肝臟胰島素受體mRNA表達的影響。方法動物分為5組，每組8只，陽性對照組給予鹽酸二甲雙胍片，給藥組分別給予卷柏水提液及大孔樹脂50%乙醇洗脫組分(簡稱50%組分)，用RT-PCR方法檢測大鼠肝臟胰島素受體mRNA表達水平。結(jié)果陽性對照組、卷柏水提液、卷柏50%乙醇洗脫組分與模型組比較，大鼠肝臟胰島素受體基因mRNA表達水平顯著提高(P＜0.01)。結(jié)論卷柏通過改善

2、大鼠肝臟胰島素受體基因mRNA表達而改善胰島素抵抗?！娟P(guān)鍵詞】卷柏；肝臟胰島素受體；mRNA卷柏為卷柏科植物卷柏Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring及墊狀卷柏S.pulvinata(Hook.etGrev.)Maxim.的全草。具有活血通經(jīng)之功效，用于經(jīng)閉痛經(jīng)，癥瘕痞塊，跌撲損傷，本實驗前期工作已經(jīng)篩選了活性部位，證實其50%乙醇洗脫組分為活性部位［1］。本研究在此基礎(chǔ)上，深入探討了卷柏對胰島素抵抗大鼠肝臟胰島素受體mRNA表達的影響，為其機制的進一步研究提供實驗

3、依據(jù)。61材料和方法1.1實驗動物清潔級雄性SD大鼠，雄性，體重180～220g，購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證編號：SCXR(寧)2005-001，自由攝食和飲水，室溫保持在(20±2)℃，濕度(50±1)%。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。1.2試劑與材料卷柏購自毫州藥材市場，經(jīng)寧夏藥檢所鑒定為卷柏。鹽酸二甲雙胍片，批號20070915，規(guī)格0.5g/片，杭州中美華東制藥有限公司；AB-8型大孔吸附樹脂，購自南開大學(xué)化工廠；rTaq酶，美國Promega公司；MgCl2、10×bufer、PCRM

4、arker、Trizol試劑，美國Invitrogen公司。Primer5.0軟件設(shè)計，上游引物序列為5'-CCGGCGTGGCCTGCCCTCTGAT-3'，下游引物序列為5'-ATGATCACAGACTACCTGCT-3'，引物由上海博亞生物有限公司合成。β-actin(540bp)5'-GTCACCCACACTGTGCCCATC3'，5'ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG-3'。61.3樣品制備卷柏2kg，粉碎，水煎煮3次，每次1h，濾過，合并提取液，濃縮得濃膏(1mg/mL)。所得

5、濃膏經(jīng)大孔樹脂柱層析(樹脂與生藥質(zhì)量比為1∶1)，分別用水、50%乙醇洗脫，得各洗脫部位，棄去水洗脫部分，將50%乙醇洗脫液濃縮，備用。1.4實驗方法1.4.1模型制備及分組大鼠40只，體重180～220g，普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機分為5組，分別為正常對照組、模型組、陽性對照組、卷柏水提液組、大孔樹脂50%乙醇洗脫組分(簡稱50%組分)，每組動物8只。除正常對照組外，其余組大鼠1周后改喂高熱量飼料制備動物模型(飼料組成：豬油15%，花生10%，蛋黃粉及糖、鹽等，其余為基礎(chǔ)飼料)10周［2］，自1

6、0周始，正常對照組和模型組灌胃(ig)給予等體積生理鹽水，陽性對照組給予鹽酸二甲雙胍0.33g/(kg·d)，ig；治療組分別給予卷柏水提液0.08g/(kg·d)，50%組分0.028g/(kg·d)，ig，共給藥2周(以臨床劑量為依據(jù)，由人鼠換算公式及提取分離轉(zhuǎn)化率換算而得)。末次給藥2h后，將大鼠處死，取肝組織，迅速置-70℃冰箱凍存，備用。1.4.2總RNA提取6取凍存的肝組織約0.1g，采用Trizol試劑提取組織的總RNA，操作按說明進行。計算所提RNA量，使A260/A280比值保持在

7、1.8以上。1.4.3cDNA的合成取上述標本RNA2μg，加入總量20μL下述混合液體。20μL反應(yīng)體系：5×bufer4.0μL；10mmol/LdNTP2.0μL；逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μL；上、下游引物各0.5μL，25mmol/L；MgCl21.5μL；RNA2.0μg；加入去核糖核酸酶(Rnase)的蒸餾水至20μL。37℃反應(yīng)1h，95℃5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。合成好的cDNA置于-20℃?zhèn)溆谩?.4.4RT-PCR檢測肝臟胰島素受體mRNAPCR擴增管中加總量25μL下述混合液。20μL反應(yīng)體

8、系：模板cDNA1.0μL；5×緩沖液5.0μL；10mmol/LdNTP2.0μL；rTaq酶1.0μL；上、下游引物各0.5μL；加入雙蒸水至20μL。反應(yīng)條件：94℃，30s；55℃，60s；68℃，60s，30個循環(huán)后，72℃延伸5min。1.4.5RT-PCR產(chǎn)物分析取10μLPCR產(chǎn)物，1.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并記錄拍照。采用Kodak2.0軟件對PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳進行掃描分析及數(shù)據(jù)處理。1.5統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS12.0統(tǒng)計軟件，