大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對淋巴細(xì)胞增殖影響的體外實驗

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1、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對淋巴細(xì)胞增殖影響的體外實驗【摘要】目的：探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對淋巴細(xì)胞增殖的影響。方法:常規(guī)分離培養(yǎng)大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)及淋巴細(xì)胞,滅活后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)48h后，MTT法檢測淋巴細(xì)胞的相對細(xì)胞數(shù)，Hoechst33258染色觀察細(xì)胞核變化。結(jié)果:MTT結(jié)果顯示，加入MSCs組OD值明顯低于未加MSCs的對照組（p＜0.05）。Hoechst33258染色顯示MSCs組淋巴細(xì)胞有核固縮及凋亡小體出現(xiàn)。結(jié)論:MSCs對淋巴細(xì)胞的增殖有抑制作用，其作用機制可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)?！娟P(guān)鍵

2、詞】間充質(zhì)干細(xì)胞；淋巴細(xì)胞；細(xì)胞增殖骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是骨髓中的具有多向分化潛能的干細(xì)胞，在造血調(diào)控、組織工程和基因治療等方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。已有實驗表明體外擴增培養(yǎng)的MSC可以抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng),減輕移植排斥,延長移植物的生存時間等,其免疫調(diào)節(jié)功能研究已是移植治療中的研究熱點[1-3]。我們實驗顯示MSCs對淋巴細(xì)胞的增殖抑制作用明顯，其作用機制可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。1材料和方法61.1主要試劑及儀器SD大鼠購自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心動物中心,6周齡，體重約60～80g。DMEM、RPMI1640培

3、養(yǎng)基（美國Gibco公司），淋巴細(xì)胞分離液(Pharmacia公司),IL2(Sigma公司),青霉素、鏈霉素（華北制藥有限公司），小牛血清（蘭州中美合資民海生物有限公司），胰蛋白酶（美國Gibco公司），超凈工作臺(日本NUAIR公司),二氧化碳培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），全自動酶標(biāo)儀（德國BIORAD，Model550)。1.2方法1.2.1大鼠MSCs的分離和培養(yǎng)采用全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)MSCs。48h后棄懸浮細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)已貼壁細(xì)胞。細(xì)胞生長至80～90％融合后，改用10%小牛血清

4、的DMEM低糖培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。1.2.2大鼠脾臟淋巴細(xì)胞的制備無菌取出大鼠脾臟，研磨過尼龍網(wǎng)，分散的淋巴細(xì)胞透過尼龍網(wǎng)后應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液獲得淋巴細(xì)胞。洗滌2次后重懸于10%小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基中。在37℃飽和濕度的CO2孵箱中孵育2-4h后，收集未貼壁懸浮細(xì)胞。1.2.3MTT法淋巴細(xì)胞混合反應(yīng)實驗6取第三代對數(shù)生長期MSCs經(jīng)30Gy60Co照射后按1×104個/孔，淋巴細(xì)胞按5×104個/孔的種入96孔板中，各孔均加入刺激劑IL2（1000U·mL-1）。37℃飽和濕度CO2孵箱中孵育48h，MTT法檢測淋巴細(xì)胞相

5、對細(xì)胞數(shù)。1.2.4Hoechst33258染色經(jīng)30Gy60Co照射后的MSCs與淋巴細(xì)胞按1:5比例接種于含10%胎牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基的25cm2培養(yǎng)瓶中，并加入刺激劑為IL2（1000U·mL-1）。CO2孵箱中培養(yǎng)48h后采用50μg·mL-1Hoechst33258染色10min，PBS洗滌2次后涂片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核。2結(jié)果2.1MSC的分離、培養(yǎng)及鑒定MSC通常在培養(yǎng)2天左右,可以出現(xiàn)單個分散存在或形成只有幾個細(xì)胞的克隆,細(xì)胞形態(tài)呈長梭形。貼壁的MSC增殖迅速,培養(yǎng)10天左右每個克隆包含100-200

6、個細(xì)胞,12-15天時細(xì)胞呈現(xiàn)80-90%融合(圖1)。體外分化實驗顯示其能分化為成骨、成軟骨及神經(jīng)等多種細(xì)胞。圖1原代培養(yǎng)第3代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞2.2MSCs抑制淋巴細(xì)胞增殖作用結(jié)果MTT結(jié)果顯示加入MSCs的實驗組淋巴細(xì)胞數(shù)比未加MSCs的對照組明顯減少，并具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01），見表1。表16MSCs抑制淋巴細(xì)胞增殖作用結(jié)果*注：*與對照組相比，p＜0.012.3Hoechst33258染色結(jié)果經(jīng)IL2刺激培養(yǎng)48h后，與MSCs共同培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞有分裂的細(xì)胞核碎片出現(xiàn)，而未加MSCs的淋巴細(xì)胞細(xì)胞核完整，沒有核固縮

7、和核脆裂現(xiàn)象。MSCs的實驗組淋巴細(xì)胞凋亡率明顯升高（p＜0.01），見表1。3討論對MSC功能研究發(fā)現(xiàn),其除可以作為組織工程研究的種子細(xì)胞外,還具有支持體外造血,促進體內(nèi)造血重建的功能。最近研究發(fā)現(xiàn)MSC具有免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用，如誘導(dǎo)免疫耐受，抑制排斥反應(yīng)，提高器官移植的成功率并能減輕自身免疫疾病的病情等[2-5]。本實驗證實MSCs可在體外顯著抑制由IL2引起的淋巴細(xì)胞增殖，同Bartholomew等[3,4]報道一致。已有研究表明MSCs不僅引起了淋巴細(xì)胞的增殖停滯，還可能誘導(dǎo)了淋巴細(xì)胞的凋亡或死亡。如Plumas[6]等發(fā)現(xiàn)MSC

8、s可以引起活化淋巴細(xì)胞凋亡的發(fā)生，其原因可能與吲哚胺2，3－二氧化酶的作用有關(guān)。我們也發(fā)現(xiàn)與MSCs共同培養(yǎng)48h后的淋巴細(xì)胞出現(xiàn)核固縮及分裂的細(xì)胞核小塊，推測MSCs可能誘導(dǎo)了淋巴細(xì)胞的凋亡，但其作用機制