hcv5′ncr和結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列的克隆及對pa317細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

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1、HCV5′NCR和結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列的克隆及對PA317細(xì)胞的轉(zhuǎn)染HCV5′NCR和結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列的克隆及對PA317細(xì)胞的轉(zhuǎn)染2009-12-13傅涌水 呂凌 王斌  【摘要】 目的 進(jìn)一步研究丙型肝炎病毒5′NCR對結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因的表達(dá)調(diào)控。方法 以拼接好的HCV5′NCR,C,E1和E2/NS1區(qū)基因共長2547個核苷酸片段克隆于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LNSX得重組體pLHC2547,用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及核苷酸序列分析等方法對重組體進(jìn)行鑒定。通過磷酸鈣-DNA共沉淀法把經(jīng)鑒定的重組體轉(zhuǎn)染入P

2、A317細(xì)胞,用G418進(jìn)行克隆篩選,以NIH3T3細(xì)胞測其病毒滴度。提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞DNA及培養(yǎng)上清RNA分別用PCR和逆轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行鑒定。結(jié)果 培養(yǎng)上清的病毒滴度為2×105CFU/ml,PCR及逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)分別可以從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞DNA及培養(yǎng)上清中擴(kuò)增出HCV的基因片段。結(jié)論 目的基因已整合到細(xì)胞的基因組中并得以表達(dá)?!  娟P(guān)鍵詞】 克隆,分子  肝炎病毒,丙型  逆轉(zhuǎn)錄病毒  轉(zhuǎn)染CloningofHCV5′NCR,C,E1,E2/NS1sequencesanditstransf

3、ectionintothePA317cellline FuYongshui,LuLing,WangBing. TheResearchCenterofMolecularMedicine,ZhongshanMedicalUniveristy,Guangzhou510089  【Abstract】 Objective ThestudywasperformedasbasicresearchpreparingforfurtherinvestigationonHCVgeneregulation.Methods

4、 Thetargetgenewasa2547bpHCV-cDNA(HCV2547)ligatedbyPCRandinsertedintothesmaⅠsiteofpGEM-3Zf(+)previonsly,containingthewhole5′NCR,C,E1,E2/NS1.UsingPstⅠandEcoRI,thetargetgenewascutandclonedintothehindⅢsiteofaretroviralvectorLNSXandarecombinantpLHC2574wasy

5、ieldedthereafter,whichwasfurtheranalysedbypolymerasechainreaction(PCR)andsequenced.Bymeansofco-precipitationwithcalciumphosphate,therecombinantpLHC2547wastransfectedintoPA317cells.ThelineswerescreenedwithG418andthevirustiterinsupernatantofthecoloneswa

6、sdeterminedbyNIH3T3cells.DNAwasextractedfromtransfectedcellsandtestedbyPCRwithHCVspecificprimers.RNAwasalsoextractedfromthesupernatantofcellcultureandwastestedbyRT-PCR.Results Thevirustiterwas2×105CFU/ml.BoththeresultofPCR,RT-PCRshowedpositive.Conclus

7、ion HCV2547sequencehadbeenintegratedintothegenomicgroupsofcellsandthetargetgenehadbeenexpressed.  【Keywords】 Cloning,Molecular  HepatitisCvirus  Retrovirus  Transfection  丙型肝炎病毒(HCV)為單股正鏈RNA病毒,基因組長約9400核苷酸(nt),其中5′末端非編碼區(qū)(5′NCR)長341nt,核殼蛋白編碼區(qū)(C區(qū))和包膜蛋白1

8、編碼區(qū)(E1)分別為573和576nt,包膜蛋白2編碼區(qū)(E2/NS1區(qū))長1038個nt,這4段序列共長約2528個nt,含有HCV5′NCR及全部結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因[1,2]。本研究應(yīng)用分子克隆技術(shù)將拼接好的這4段序列正向插入LNSX載體的HindⅢ位點構(gòu)建重組體pLHC2547,然后用磷酸鈣-DNA共沉淀的方法將重組DNA轉(zhuǎn)染入PA317細(xì)胞,以利于細(xì)胞內(nèi)表達(dá)調(diào)控的研究。材料與方法  一、材料來源  LNSX,PA317由本校梁振東博士提供。PstⅠ,EcoRⅠ,HindⅢ系p

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