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《教案實(shí)驗(yàn)四 黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、實(shí)驗(yàn)四黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸【目的要求】1.掌握實(shí)驗(yàn)室菌種種子生產(chǎn)方法。2.掌握檸檬酸發(fā)酵原理及過(guò)程,掌握檸檬酸液體發(fā)酵及中間分析方法。3.熟悉并記錄黑曲霉培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基中基質(zhì)的變化與產(chǎn)物的形成情況;4.掌握鈣鹽法提取檸檬酸的原理與方法。【基本原理】黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸實(shí)驗(yàn)中需要大量活化的孢子,其制備是采用麩皮培養(yǎng)基中保藏的黑曲霉孢子,在新的麩皮培養(yǎng)基上于適當(dāng)?shù)臏囟认禄罨⒋罅糠敝常瑥亩a(chǎn)生大量活化孢子。黑曲霉發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸的代謝途徑被認(rèn)為是:黑曲霉生長(zhǎng)繁殖時(shí)產(chǎn)生的淀粉酶、糖化酶首先將薯干粉或玉米粉中的淀粉轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?;葡萄糖?jīng)過(guò)酵解途徑(EMP)轉(zhuǎn)變?yōu)楸?;丙酮酸氧化脫羧形成?/p>
2、酰輔酶A,然后在檸檬合成酶的作用下生成檸檬酸。黑曲霉在限制氮源和錳等金屬離子條件下,同時(shí)在高濃度葡萄糖和充分供氧的條件下,TCA循環(huán)中的酮戊二酸脫氫酶受阻遏,TCA循環(huán)不能充分進(jìn)行,使檸檬酸大量積累并排出菌體外。其理論反應(yīng)式為:C6H12O6+1.5O2→C6H8O7+2H2O以薯干粉或玉米粉為原料的黑曲霉檸檬酸發(fā)酵液,除了含有大量檸檬酸外,還有大量的菌體,少量沒(méi)有被黑曲霉利用的殘?zhí)恰⒌鞍踪|(zhì)、脂肪、膠體化合物以及無(wú)機(jī)鹽類等。檸檬酸提取就是從成分復(fù)雜的發(fā)酵液中分離提純獲得檸檬酸。從檸檬酸發(fā)酵液中提取檸檬酸的方法主要有:鈣鹽-離子交換法、溶劑萃取法、“吸交”法、離子色譜法等。目前國(guó)外生產(chǎn)
3、主要采用鈣鹽-離子交換法和溶劑萃取法;國(guó)內(nèi)生產(chǎn)主要采用鈣鹽-離子交換法,“吸交”法和離子色譜法正在推廣中。鈣鹽法首先采用過(guò)濾或超濾除去發(fā)酵液中的菌絲體等不溶殘?jiān)?,然后在澄清過(guò)濾液中加入碳酸鈣(或氫氧化鈣)發(fā)生中和反應(yīng),生成難溶的檸檬酸鈣沉淀,利用在80-90℃下檸檬酸鈣的溶解度極低的特性,通過(guò)過(guò)濾(或離心)將它與可溶性的糖、蛋白、氨基酸、其它有機(jī)酸、無(wú)機(jī)離子等雜質(zhì)分離開,用80-90℃熱水反復(fù)洗滌檸檬酸鈣,除去殘?zhí)呛推渌扇苄噪s質(zhì),經(jīng)過(guò)濾(或離心)獲得較凈的檸檬酸鈣,然后在洗凈的檸檬酸鈣中緩慢地加入稀硫酸進(jìn)行酸解反應(yīng),生成檸檬酸和硫酸鈣沉淀,經(jīng)過(guò)濾(或離心)除去硫酸鈣沉淀,獲得粗制的
4、檸檬酸。其主要反應(yīng)式為:2C6H8O7·H2O+3CaCO3Ca3(C6H5O7)2·4H2O+3CO2+H2OCa3(C6H5O7)2·4H2O+3H2SO4+4H2O2C6H8O7·H2O+3CaSO4·2H2O【實(shí)驗(yàn)用品】1.實(shí)驗(yàn)主要儀器設(shè)備超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、滅菌鍋、三角瓶(500mL)搖床;離心機(jī);分析天平;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器;分光光度計(jì);比色管;容量瓶;濾布;布氏漏斗;滴定管;水浴鍋;試管、燒杯、500ml三角瓶等若干2.材料菌種:黑曲霉(本實(shí)驗(yàn)室保存)培養(yǎng)基:麩皮培養(yǎng)基。黑曲霉種子培養(yǎng)基:20%玉米粉糖化過(guò)濾液。發(fā)酵培養(yǎng)基:20%葡萄糖溶液與過(guò)濾后的玉米糖化過(guò)濾液按比例混合
5、。2.實(shí)驗(yàn)藥品0.1429mol/LNaOH,1%酚酞試劑,碳酸鈣,95%乙醇,濃硫酸;0.1429mol/LNaOH,1%酚酞試劑,3,5二硝基水楊酸試劑,葡萄糖;草酸銨結(jié)晶紫液(A液:1%結(jié)晶紫95%酒精溶液:B液:1%草酸銨溶液。取A液20mL,B液80mL混合,靜置48小時(shí)后使用)【方法步驟】一、麩曲的制備1麩皮培養(yǎng)基的配置將麩皮用紗布袋裝好,用自來(lái)水將麩皮反復(fù)揉洗直至洗液澄清,擠去水分至有水感而水不下滴為宜。將洗凈的麩皮裝入500ml干凈的錐形瓶中,裝入量約為錐形瓶體積的1/5,蓋好四層紗布,并用牛皮紙包好。2培養(yǎng)基滅菌將裝好的麩皮培養(yǎng)基以高壓蒸汽滅菌法滅菌,保持121.3
6、℃,滅菌30min。3接種3.1孢子懸浮液的制備取保藏黑曲霉菌種,用接種環(huán)挑取少許菌落裝入含有玻璃球的三角瓶中,加20ml無(wú)菌水,蓋好塞子震蕩數(shù)分鐘,即得孢子懸浮液。3.2種曲的制備吸取孢子懸浮液5ml接入麩曲培養(yǎng)基中,然后攤開紗布、扎好,并在掌心輕輕拍三角瓶,使孢子和培養(yǎng)基充分混合,于30-32℃下恒溫培養(yǎng)1d后,再次拍勻,于35℃下培養(yǎng),每隔12-24h搖瓶一次,孢子長(zhǎng)出后停止搖瓶,這樣繼續(xù)培養(yǎng)3-4d,即成種曲。二、搖瓶種子制備1搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的配置將玉米粉用80目篩子篩好備用,稱取200g玉米粉于燒杯中,同時(shí)加入自來(lái)水800ml,即質(zhì)量比自來(lái)水:玉米粉為4:1,混勻。2培養(yǎng)基
7、的糖化將培養(yǎng)基置電熱板上攪拌加熱,70℃加入淀粉酶2.0g,水解20min,取少量培養(yǎng)基加水稀釋后用碘指示劑檢驗(yàn),與淀粉液進(jìn)行對(duì)照,如變藍(lán)表明水解糖化不完全,需補(bǔ)加淀粉酶繼續(xù)水解至不變藍(lán),即糖化完全,用雙層紗布過(guò)濾,即得到20%玉米水解過(guò)濾液。3分裝、滅菌將配制好的培養(yǎng)基裝入搖瓶(錐形瓶)中,裝入量為搖瓶總體積的1/10,2層紗布封口,121.3℃,滅菌15-20min。4接種待培養(yǎng)基溫度降至40℃以下時(shí),將活化的黑曲霉孢子(約為4-5片麩皮)接種入培養(yǎng)基