淀粉酶菌株的選育、發(fā)酵工藝的研究和酶的純化

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1、淀粉酶菌株的選育、發(fā)酵工藝的研究和酶的純化摘要：淀粉酶是最早用于工業(yè)生產(chǎn)并且迄今仍是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一，為了提高淀粉酶的生產(chǎn)水平，首先通過淀粉培養(yǎng)基從土壤中篩選出產(chǎn)淀粉酶的活性菌株，對(duì)菌株初步鑒定后進(jìn)行紫外線誘變，篩選出產(chǎn)量高、性狀優(yōu)良的突變菌株，再用正交試驗(yàn)的方法對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)最后采用硫酸銨沉淀法初步純化發(fā)酵得到的淀粉酶并對(duì)酶活性進(jìn)行了測(cè)定。關(guān)鍵詞：淀粉酶；分離篩選；紫外線誘變；優(yōu)化；提純1、引言淀粉酶是能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶，是最早用于工業(yè)生產(chǎn)并且迄今仍是用途最廣

2、、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一。淀粉酶種類繁多，特點(diǎn)各異，在造紙、印染、釀造、果汁和食品加工、醫(yī)藥、洗滌劑、工業(yè)副產(chǎn)品及廢料的處理、青貯飼料及微生態(tài)制劑等多種領(lǐng)域具有廣闊的用途。我國是傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)大國，發(fā)展淀粉深加工工業(yè)是解決當(dāng)前淀粉生產(chǎn)積壓的好出路，而幾乎所有淀粉深加工工業(yè)的基礎(chǔ)都是以淀粉質(zhì)原料的水解作為第一步，因此淀粉質(zhì)原料的液化情況直接關(guān)系到產(chǎn)品后期的加工工藝和產(chǎn)品的質(zhì)量。所以，改進(jìn)淀粉液化工藝也是降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品市場競爭能力的一種重要手段。顯然，改進(jìn)淀粉液化工藝首要任務(wù)就是提高淀粉酶的生產(chǎn)水平。那如何提高淀粉酶的生產(chǎn)水平呢？我們知道，現(xiàn)在淀粉

3、酶主要來源于植物和微生物，并通過發(fā)酵完成生產(chǎn)，因此篩選出高產(chǎn)、穩(wěn)定的淀粉酶產(chǎn)生菌是淀粉酶生產(chǎn)的頭等大事。本文試圖從土壤中分離出產(chǎn)淀粉酶的枯草桿菌，通過紫外線誘變育種及發(fā)酵條件優(yōu)化來得到高產(chǎn)、穩(wěn)定的淀粉酶產(chǎn)生菌株，并對(duì)發(fā)酵得到的淀粉酶進(jìn)行初步提純，以達(dá)到加深對(duì)發(fā)酵工程上游技術(shù)中菌種選育的認(rèn)識(shí)、掌握紫外線誘變育種的原理和方法、了解發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)物形成的影響、熟悉發(fā)酵條件的優(yōu)化方法、掌握分光光度法測(cè)液化型淀粉酶活力的基本原理和方法、掌握初步純化淀粉酶的方法的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2．1．1樣品：貴師大綜合樓附近的土壤2．1．2培養(yǎng)基和試劑：淀

4、粉培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨（斜面）、牛肉膏蛋白胨（液體）種子培養(yǎng)基、淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基、生理鹽水、碘液、2％可溶性淀粉、硫酸銨、乙酸溶液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)糊精溶液2．1．3儀器設(shè)備：全自動(dòng)高壓滅菌鍋、培養(yǎng)皿、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、恒溫?fù)u床、離心機(jī)、分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、移液管、PH試紙、吸耳球、玻璃棒、量筒、試管、試管架、酒精燈、電子天平、三角燒瓶、洗瓶、接種針、接種環(huán)、直尺、記號(hào)筆等。2.2實(shí)驗(yàn)方法2．2．1細(xì)菌的分離與初步鑒定：將土壤系列稀釋，把10-3、10-4、10-5分別涂布到淀粉培養(yǎng)基上，27℃倒置培養(yǎng)2天，將長出的菌落接入斜

5、面。將細(xì)菌從斜面接種到淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)2天，用碘液染色，記錄透明圈大小和菌落直徑，計(jì)算D/d值。保菌供下次實(shí)驗(yàn)用。2．2．2紫外線誘變育種：取活化后的菌種配成菌懸液、稀釋；倒淀粉培養(yǎng)基平板，將菌懸液涂布其表面；用紫外線處理平板0、2min、4min、6min、8min、10min，每個(gè)處理2次重復(fù)；放到黑暗中倒置培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)48h，分別計(jì)數(shù)誘變組和對(duì)照組平板上的菌落數(shù)，并計(jì)算致死率；加入碘液，分別測(cè)量誘變組和對(duì)照組菌落的透明圈直徑和菌落直徑，計(jì)算D/d值；將D/d值最大的菌種保存到斜面培養(yǎng)基上。2．2．3生產(chǎn)菌株搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化2．2．3．1培養(yǎng)

6、基初始pH值和裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響：用1mol/L鹽酸或1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值，使培養(yǎng)基的pH值為5.0、7.0、9.0，分裝至250mL三角瓶中，每瓶25mL，滅菌，冷卻后編號(hào)1、2、3，再接種，37℃下恒溫?fù)u床培養(yǎng)48h（搖瓶裝液量分別30％、40％、50％），最后測(cè)定發(fā)酵液酶活。編號(hào)處理項(xiàng)1號(hào)2號(hào)3號(hào)PH579裝液量30％40％50％A66010-110-22.2.3.2培養(yǎng)基碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響：在不含可溶性淀粉的培養(yǎng)基中，分別加入0.5％的各種碳源（可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖），以硝酸銨作為唯一氮源，進(jìn)行碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響的發(fā)酵試驗(yàn)。處

7、理結(jié)果可溶性淀粉葡萄糖蔗糖A66010-110-22.2.3.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)：通過三因素兩水平的正交試驗(yàn)對(duì)高產(chǎn)菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，建立高產(chǎn)菌株的最佳搖瓶發(fā)酵條件。因素處理接種量淀粉含量蛋白胨含量處理一3％5g/L5g/L處理二3％10g/L10g/L處理三5％5g/L10g/L處理四5％10g/L5g/L2．2．4淀粉酶的初步提純及酶活性的測(cè)定2.2.4.1淀粉酶的初步提純：收集發(fā)酵液，3000r/min離心10min，去除菌體，在上清液中加入65％飽和度的硫酸銨，待硫酸銨充分溶解后于4℃鹽析2h，然后5000r/min離心20min，得到初步純化

8、的淀粉酶。2.2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和酶活性的測(cè)定：將可溶性淀粉稀釋成0.2％、0.5％、1％、1.5％和