真菌dna提取及擴增方法

真菌dna提取及擴增方法

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1、一真菌DNA提取方法取已純化的真菌菌絲。采用改良氯化芐法提取DNA。具體方法如下:(1)0.1g菌體,在1.5ml離心管中加入500μLDNA提取液,先振蕩使之充分混勻。(2)10%SDS100μL和300μL氯化卞,劇烈振蕩,渦旋混勻,使管內(nèi)混合物成乳狀。(3)于56℃水浴保溫1h,每隔10min振蕩混勻一次。(4)加入3M醋酸鈉(pH5.2)300μL,冰浴15min12000rpm,4℃離心15min。(5)收集上清液(約600μL,記住收集的上清液的體積),放入另一新離心管中,再加入等體積的氯仿:異戊

2、醇(V:V=24:1)劇烈振蕩使之充分混勻,并形成懸乳狀。12000rpm,4℃離心15min。(6)如上5操作再抽提一次,移至另一新離心管中。(7)加入兩倍體積的冷無水乙醇,上下轉(zhuǎn)動混勻,放入-20℃冰箱過夜,使DNA沉淀。(8)12000rpm,4℃離心15min,收集沉淀。(9)沉淀用1000μL75%冷乙醇洗滌5min,重復兩次,然后棄去冷乙醇。(10)真空干燥,將DNA溶于50μLTE緩沖液或ddH2O中,4℃冰箱保存?zhèn)溆?。二真菌的PCR擴增以提取的基因組DNA為模板,用真菌通用引物ITS4(5′-

3、TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)對真菌rDNA的ITS區(qū)域利進行PCR擴增。PCR反應體系(25)μL:PCRBuffermaxture2.5μL;10mmol/LdNTP1μL;引物ITS4/ITS5(10μmol/L)各1μL;模板DNA2μL;5U/μLTaqDNA聚合酶0.4μL;ddH2O17.1μL。PCR反應程序:95℃預變性4min,94℃變性30s,53℃復性30s,72℃延伸40s,進行35個循環(huán),最后7

4、2℃延伸7min,用無菌水代替模板作陰性對照,PCR產(chǎn)物-20℃保存。細菌和古菌4.1.1.1酶法小量DNA提取1.50mg菌體(或直接用竹簽挑取純菌落)于EP管中,加1×TE480ul,稀釋成20mg/ml的溶菌酶20μL,放入37℃搖床2—3小時;2.加20%SDS50μL及蛋白酶pK5μL震蕩混勻1分鐘,放入55℃搖床(或烘箱)30-60分鐘〔pK濃度為20ug/mL〕;3.加550μL苯酚:氯仿:乙戊醇(25:24:1)取下層,震蕩混勻,12000rpm離心10分鐘,吸取上清液(不要吸到中間渣滓,重復

5、抽提2次);4.上清液加入50μL3mol/L乙酸鈉(PH4.8-5.2)混勻后加500μL異丙醇,放入-20℃冰箱1-2小時或過夜;或者加800ul無水乙醇,加80μL3mol/L乙酸鈉(PH4.8-5.2)室溫放置10分鐘以上;5.12000rpm離心10分鐘,去除上清液,加200μL70%乙醇,輕搖洗鹽1—2次,12000rpm低溫離心5分鐘,棄乙醇;6.(37-55)℃干燥后加1×TE50μL溶解DNA(視DNA量而定),-20℃保存?zhèn)溆?。注意干燥時間不宜過長,一般20-30min,時間太長,DNA不

6、宜溶解。4.PCR引物細菌及放線菌PCR引物采用通用引物PA/PB,序列為:正向引物PA:5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’反向引物PB:5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’古菌引物:正向引物P1:5’-ATTCCGGTTGATCCTGCCGGA-3’反向引物P2:5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-3’引物由Sangon公司合成。5.PCR擴增PCR反應采用熱啟動程序。PCR所用的10×Buffer、TaqDNA聚合酶、dNTP均購自昆明好科迪經(jīng)貿(mào)有限公司。反應體系如

7、表1所列。表4-1PCR反應體系10×Buffer5.0uLdNTP4.0uLPA1.0uLPB1.0uLTaq酶0.3uLD.D.Water37.7uLDNATemplate1.0uL加石蠟油30uL6.PCR反應條件采用熱啟動PCR反應程序,PCR儀采用Biometra公司產(chǎn)品。反應條件如表2所列。表4-2PCR反應條件95℃預變性4min80℃暫停加酶95℃變性1min56℃退火1min72℃延長2min30個循環(huán)72℃延長10min4℃保存24h一般蓋子的溫度為99℃

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