直接化學發(fā)光與電化學發(fā)光之比較

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1、直接化學發(fā)光與電化學發(fā)光之比較自1982年人們就開始研究將電促化學發(fā)光標記物（ECL）用于各種免疫檢查，但直到最近，隨著羅氏公司力圖將這一技術用于其新系列的儀器中，才重新引起人們對電化學發(fā)光的關注。盡管電化學發(fā)光標記物同經(jīng)典的化學發(fā)光標記物吖啶酯（AE）有很多相似的特性，但在技術細節(jié)方面并不相同，這使得電化學發(fā)光并不適合于現(xiàn)代自動免疫儀器。本文詳細探討了電化學發(fā)光的技術特點以及該技術對儀器性能的局限性，并根據(jù)廠家所給的性能指標將電化學發(fā)光系統(tǒng)與采用AE技術的儀器進行了比較。盡管同老式的手工操作或與采用比色法、包被管和酶免法的半自動分析儀相比，羅氏公司的

2、儀器在檢測技術和操作特性上頗具吸引力，但實際上羅氏所面對的真正競爭對手并非這些過時的技術，而是象Bayer診斷產品公司出品的ACS：180SE這樣的先進儀器。背景與發(fā)展過程早在19世紀20年代，人們就觀察到電解過程中的發(fā)光現(xiàn)象，但在60年代以前，很少有人對此現(xiàn)象進行研究。從1982年開始，人們就一直在研究將可產生電促發(fā)光的三聯(lián)吡啶衍生物應用于免疫實驗中。1991年，IGEN公司（美國馬里蘭州洛克威爾公司）推出了采用這一技術的商品化儀器和試劑，1990年和1991年，IGEN公司分別與ESAI公司（日本）和羅氏公司簽訂協(xié)議，共同發(fā)展免疫檢驗項目，并授予它

3、們ECL技術的使用權。電化學發(fā)光“理論上”的優(yōu)越性ECL具有許多與AE相同的優(yōu)點，但在理論上，ECL較之目前AE技術的最重要的優(yōu)越性就是其具有更高的靈敏度，該論點是基于電化學標記物具有循環(huán)參與電化學反應的能力，每個標記物分子可多次產生光子。但在實際中，即使ECL所宣傳的檢測范圍也一直沒有超過AE的檢測限，而且，采用ECL的免疫實驗較之大量采用AE技術的商品化免疫項目并沒有顯示其具有更優(yōu)越的靈敏度。電化學發(fā)光的缺點ECL有三個最主要的缺點：l檢測標記物時需要三個電極（一個金/鉑激發(fā)電極，兩個測定電極），3000美元/5000美元一個，需更換。l儀器采用的

4、流動比色池，交叉污染為潛在問題。l對環(huán)境因素和其它非特異性反應過于敏感。采用ECL技術的儀器需要三個電極，每個電極都會涉及到電極的穩(wěn)定性、重復性、污染問題和額外的常規(guī)維護。另外，儀器所采用的流動式設計和電極本身都會造成嚴重的交叉污染問題。因此，這些儀器在每個測定間都需要進行化學清洗、化學調節(jié)和電極調節(jié)，這些清洗和調節(jié)過程使得每次測試都要產生大量的廢液并嚴重限制了儀器的檢測速度。大量的固相物也易于與上次實驗的殘留試劑反應，這使得羅氏公司所推出的隨機任選式儀器的試劑交叉污染問題更為嚴重。最后，電化學反應的復雜性也使其容易受到更多因素的干擾，對于一些使用近似

5、的稀土螯合物的免疫實驗，干擾很可能來自金屬離子的污染（樣品管、加樣頭或實驗用水），或是存在EDTA和其它作為抗凝劑或防腐劑的金屬螯合物。另外，反應副產品的沉積也是一個潛在的干擾源。在這類儀器中，由于緩沖液中存在高濃度的TPA造成自身的電化學發(fā)光，使得背景信號過高，光子的產生對6到7范圍內的pH值非常敏感。很明顯，ECL所用試劑如果不避光保存將很不穩(wěn)定并易于自發(fā)光，遭致失效。以下總結了采用AE標記物的直接化學發(fā)光和采用Ru(bpy)32＋標記物化學發(fā)光之間的關鍵區(qū)別點。表1：AE和ECL的區(qū)別點檢測的難易直接化學發(fā)光只需與H2O2反應就可激活AE。ECL

6、需要使用三個電極才能進行一個未知的、多個電活性樣品間復雜反應。速度直接化學發(fā)光AE閃光可在2秒鐘內完成。電化學發(fā)光ECL閃光在5秒鐘內完成，但需要40到60秒進行電極清洗和環(huán)境調節(jié)。靈敏度AE檢測范圍可小于10－15M，遠遠高于免疫實驗所需的靈敏度。ECL的檢測范圍據(jù)稱在10－11M到10－17M之間。背景信號由于近乎沒有純自然的化學發(fā)光，AE所產生背景信號非常低。由于高濃度的TPA所造成的電化學發(fā)光使得ECL具有較高的背景信號。特異性AE對溫度和pH值不敏感ECL對超出6到7范圍的pH值非常敏感，對金屬離子或螯合物的污染也非常敏感。最近一篇關于ECL

7、技術的綜述文章總結道：“還需要進一步的工作以解決電極污染問題，提高ECL試劑的穩(wěn)定性和效價，并對流動室的設計進行改進，由于電極和光檢測裝置間的不協(xié)調使得這一問題變得非常復雜?！焙喍灾珽CL技術的局限性隨著其在現(xiàn)代高速免疫儀器中的應用而顯得日益突出。相對于AE技術，ECL并沒有什么真正的優(yōu)勢。結論盡管同老式的手工操作或與采用比色法、包被管和酶免法的半自動分析儀相比，羅氏公司這兩款新儀器在檢測技術和操作特性上頗具吸引力，但是與此相反，同拜耳診斷產品公司首次采用了直接化學發(fā)光技術，1991年推出了全自動的ACS：180，1995年推出ACS：180Plu

8、s，1998年推出ACS：180SE。多電極檢測系統(tǒng)、流動式儀器設計、復雜的、易受干擾的化學反