植酸酶高產(chǎn)菌株的篩選與酶的分離純化

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1、植酸酶高產(chǎn)菌株的篩選與酶的分離純化一、研究意義植酸酶是催化植酸及植酸鹽水解為肌醇與磷酸（磷酸鹽）的一類酶的總稱。植酸及其鹽類普遍存在于植物體中，是植物種子及營養(yǎng)器官中磷的主要貯存方式，一般植酸磷占禾谷種子及油料作物總磷60%~80%。在人和單胃動物食物中，植酸具有強烈的抗營養(yǎng)作用。這是由于一方面人和單胃動物缺乏分解植酸的酶類，無法利用植酸中的磷，另一方面植酸能與礦質(zhì)元素如鐵鋅、鈣和鎂等蛋白質(zhì)形成不溶性的穩(wěn)定的復合物，降低了礦質(zhì)元素和蛋白質(zhì)的利用率。植酸酶作為一種新型的飼料添加劑，能分解飼料中的植酸，形成禽畜可利用的磷酸，提高飼料中有機

2、磷的利用率，減少添加無機磷，降低飼料成本，減輕磷污染，同時解除植酸的抗營養(yǎng)作用，提高飼料的營養(yǎng)價值，具有非?？捎^的經(jīng)濟效益和生態(tài)效益。二、實驗目的從土壤中篩選到一株植酸酶高產(chǎn)菌株，利用紫外線對該菌株進行誘變提高植酸酶產(chǎn)量，并采用硫酸銨分級沉淀、DEAE-纖維素陰離子交換層析和SephadexG-100凝膠過濾層析對植酸酶進行分離純化。三、實驗材料3.1材料3.1.1（1）篩選培養(yǎng)基：1%植酸鈣，3%葡萄糖，200U/ml青霉素鈉，0.5%NH4NO3，0.05%KCl，0.003%，MnSO4.4H2O，0.05%MgSO4.7H2O

3、，0.003%FeSO4·7H2O，1.5%瓊脂，pH5.5。（2）液體發(fā)酵培養(yǎng)基：1.5%葡萄糖，0.3%蛋白胨，0.2%（NH4）2SO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.05%KCl，0.003%MnSO4·4H2O，0.003%FeSO4.7H2O，pH5.5。（3）查氏合成培養(yǎng)基：硝酸鈉2g，磷酸氫二鉀1g，氯化鉀0.5g，硫酸鎂0.5g，硫酸亞鐵0.01g，蔗糖30g，瓊脂15~20g，水1000mL，pH自然，?121℃滅菌20min。?（4）斜面培養(yǎng)基：0.05%MgS04·7H2O，0.003%MnSO4·7H2

4、O，0.003%FeSO4·7H20，麩皮汁100ml，1.5~2%瓊脂，pH5.5。3.1.2土樣來源土樣采自校園共青團花園或農(nóng)田。去除土層表面枯枝、雜草和砂石，收集距表層5cm~10cm的土壤。3.2儀器水浴鍋、培養(yǎng)箱、燒杯、培養(yǎng)皿、滅菌鍋、漏斗、試管、搖床、分光光度計、pH試紙、電爐、干燥箱、超凈工作臺、移液管等四、實驗方法4.1流程土壤樣品稀釋液??測量各透明圈與菌落直徑的大小初篩保藏菌種菌種鑒定復篩測酶活保藏菌種斜面培養(yǎng)基活化（三天）紫外誘變斜面制備單孢子菌懸液平板初篩正交實驗搖床復篩測酶活測酶活分離純化4.2方法4.2.1

5、菌株的篩選：土壤樣品稀釋1×105倍，涂布于篩選培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)72h，挑取產(chǎn)生透明圈的菌株。對初篩得到的菌株進行搖瓶復篩，在220r/min的轉(zhuǎn)速下發(fā)酵培養(yǎng)，測其酶活。4.2.2酶活的測定：參照張若寒的釩鉬酸銨法略加改進后進行測定。取1ml粗酶液加入2ml植酸鈉溶液并搖勻（對照加入2ml釩鉬終止液），37℃保溫反應30min，立即加入2ml釩鉬終止液（對照加入2ml植酸鈉溶液），415nm測OD值，參照磷標準曲線計算酶活。酶活定義：按上述方法，在pH5.5的條件下，每分鐘從0.0051mol的植酸鈉溶液中釋放1umol無機磷所需

6、的酶量為一個活力單位（U）。4.2.2.1磷標準曲線制備原理：利用植酸酶水解植酸鹽釋放無機磷，通過加入酸性鉬一釩試劑，使水解反應停止，同時與水解釋放出來的無機磷產(chǎn)生顏色反應，形成黃色的釩鉬磷絡(luò)合物，在415nm波長下測定磷的含量。表1標準曲線的各反應體系試管號123456標準磷溶液(ml)00.40.81.21.62無機磷濃度(mmol/mL)0246810去離子水(ml)21.61.20.80.40釩鉬終止液222222OD值按表1加入試劑后，在415nm波長下測OD值，并繪制標準曲線。4.2.3菌種鑒定：將復篩酶活力最高的菌接種于

7、查氏合成培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3d后，觀察菌落形態(tài)變化。4.2.4誘變處理：取復篩酶活力最高的菌接的孢子懸液10ml加入直徑為9cm的無菌培養(yǎng)皿中，在15W紫外燈下，距離28cm，進行誘變處理，時間依次為0、3、6、9、12、15min。經(jīng)紫外線誘變后得到的突變株，將其中透明圈與菌落直徑比值較大的進行復篩，測定突變株的酶活。4.2.5植酸酶的分離純化：①取發(fā)酵后的培養(yǎng)液在4℃，4000r/min離心20min，取上清液，分別加入固體硫酸銨，使硫酸銨飽和度分別為20%~90%，對植酸酶進行沉淀。沉淀重新溶解在乙酸緩沖液中，對蒸餾

8、水透析脫鹽。②透析后的植酸酶溶液用DEAE-纖維素陰離子交換層析柱進行分離純化，用NaCl溶液進行線性梯度洗脫，于280nm檢測蛋白質(zhì)，分部收集，測定每管酶活力。③將上述洗脫液用SephadexG-100凝膠柱進一步分離