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《細菌視紫紅質(zhì)基因的克隆及鑒定論文》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、細菌視紫紅質(zhì)基因的克隆及鑒定論文學(xué)號:20080403801022武漢東湖學(xué)院生物技術(shù)綜合實驗論文細菌視紫紅質(zhì)基因的克隆及鑒定院系:生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院姓名:付鍇專業(yè):08級生物技術(shù)指導(dǎo)老師:金衛(wèi)華、鄧麗娟、涂毅二?一一年五月摘要本實驗室通過將視紫紅質(zhì)目的基因(即bop基因)導(dǎo)入pUC18質(zhì)粒制備得到重組質(zhì)粒,再將該重組質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌DH5α細胞中進行克隆,通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定,初步證實該實驗實現(xiàn)了視紫紅質(zhì)目的基因(即bop基因)的克隆。本次實驗,通過老師提供的大腸桿菌DH5α(含pUC18質(zhì)粒)菌種平板和大腸桿菌DH5α(不含pUC18質(zhì)粒)菌種平板
2、進行接種后對比,在氨芐青霉素選擇性培養(yǎng)基的篩選作用下,得到了含pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α;通過SDS堿裂解法制備得到了pUC18質(zhì)粒,并通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定;以實驗室老師所提供質(zhì)粒為模板,進行PCR擴增得到目的基因(帶BamHⅠ和HindⅢ的酶切位點),并通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定和回收純化;在限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ的作用下,得到酶切后的pUC18質(zhì)粒和目的基因,并通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定和回收純化;在T4DNA連接酶的連接作用下,制備出重組質(zhì)粒;通過氯化鈣制備得到感受態(tài)大腸桿菌DH5α細胞;在42℃短時間的熱沖擊處理(熱休克)下,重組質(zhì)粒被
3、感受態(tài)大腸桿菌DH5α細胞所攝取,隨著大腸桿菌DH5α細胞的增殖而克隆;為了鑒定重組質(zhì)粒確實含有視紫紅質(zhì)目的基因(即bop基因),并確實被感受態(tài)大腸桿菌DH5α細胞所攝取,并隨著大腸桿菌DH5α細胞的增殖而克隆。首先通過SDS堿裂解法提取重組質(zhì)粒;通過以重組質(zhì)粒為模板,PCR擴增得到目的基因;然后在1%瓊脂糖凝膠電泳中,通過與Maker蛋白的電泳條帶對比,進行初步鑒定,得出我們所提取的重組質(zhì)粒中含有視紫紅質(zhì)目的基因(即bop基因)。為了進一步確定結(jié)果,在限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ的作用下,我們對重組質(zhì)粒進行酶切;在瓊脂糖凝膠電泳中,通過與Maker
4、蛋白的電泳條帶對比,進一步確認(rèn)出,我們通過大腸桿菌DH5α細胞所克隆得到的重組質(zhì)粒,確實就是導(dǎo)入了視紫紅質(zhì)目的基因的pUC18質(zhì)粒。本次實驗的結(jié)果:(1)第一次堿裂解法提取質(zhì)粒后電泳鑒定時,只得到了一條不成帶形的“脫尾”亮帶,所處位置大致在1.5~2.0kb,推測出這段亮帶是不完整的被打斷的質(zhì)粒;第二次堿裂解提取質(zhì)粒后電泳鑒定時,根據(jù)亮帶所處位置,其堿基數(shù)在1.9kb左右,推測出閉合環(huán)狀的pUC18質(zhì)粒。(2)PCR擴增得到的目的條帶,堿基數(shù)在1.2kb左右,亮度較大,帶形較寬且連續(xù),推測出該條帶是擴增產(chǎn)物,且濃度較大并且純度較高;在該目的條帶下方,出現(xiàn)了
5、模糊的涂抹帶,推測出該條帶可能是PCR非特異產(chǎn)物帶;在堿基數(shù)為110bp左右,出現(xiàn)一條模糊帶,推測出該條帶可能是“引物多聚體”帶,也可能是非特異性序列帶。(3)經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ處理后,電泳只得到了一條亮帶,且亮帶處于2.1kb左右,即推測為pUC18質(zhì)粒。(4)通過SDS堿裂解法提取質(zhì)粒,電泳只得到一條亮帶,堿基數(shù)在2.2kb左右,推斷是重組質(zhì)粒;通過以重組質(zhì)粒為模板,PCR擴增電泳得到一條亮帶,堿基數(shù)在1.2kb左右,推斷是目的基因;有“彗星”尾出現(xiàn),推斷是由于沒有加入RNA酶。(5)酶切之后的產(chǎn)物出現(xiàn)兩條亮帶,根據(jù)開環(huán)pUC18質(zhì)粒
6、堿基數(shù)在2.1kb左右,酶切后的目的基因堿基數(shù)在1.1kb左右,并與酶切之前的重組質(zhì)粒亮帶對比,推測出上面一條帶是開環(huán)pUC18質(zhì)粒,下面一條帶是酶切后的目的基因。本次實驗的結(jié)論:我們通過大腸桿菌DH5α細胞所克隆得到的重組質(zhì)粒,初步確認(rèn)就是導(dǎo)入了視紫紅質(zhì)目的基因的pUC18質(zhì)粒;有關(guān)視紫紅質(zhì)目的基因的性狀表達,應(yīng)做進一步的實驗鑒定。關(guān)鍵詞:視紫紅質(zhì)基因;pUC18質(zhì)粒;基因克隆;大腸桿菌DH5α目錄摘要11.前言31.1基因工程技術(shù)31.1.1基因工程的建立與基本概念31.1.2基因工程的四大要素31.1.3基因工程的應(yīng)用進展41.2PCR技術(shù)41.3細
7、菌視紫紅質(zhì)基因的結(jié)構(gòu)功能與應(yīng)用51.4實驗原理51.4.1SDS堿裂解法制備質(zhì)粒及電泳鑒定51.4.2感受態(tài)細胞的制備61.4.3轉(zhuǎn)化子的篩選6整個基因重組試驗的基本流程圖72.材料和方法82.1培養(yǎng)基配制、滅菌、無菌接種82.1.1實驗器材和試劑82.1.2實驗方法82.2SDS堿裂解法制備質(zhì)粒及電泳鑒定82.2.1實驗器材和試劑82.2.2實驗方法92.3PCR擴增目的基因及電泳鑒定102.3.1實驗器材和試劑102.3.2實驗方法102.4PCR產(chǎn)物電泳及回收純化102.4.1實驗器材和試劑102.4.2實驗方法112.5質(zhì)粒和目的基因PCR產(chǎn)物的酶
8、切及純化112.5.1實驗器材和試劑112.5.2實驗方法112.