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《葡聚糖凝膠sephadex g–25柱層析法脫鹽分離蛋白質(zhì)實驗技術(shù)總結(jié)》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、葡聚糖凝膠SephadexG–25柱層析法脫鹽分離蛋白質(zhì)實驗技術(shù)總結(jié)引言層析法也稱色譜法，是1906年俄國植物學(xué)家Michael等發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”（Chromatography)。后來無色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。1944年出現(xiàn)紙層析，以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。層析法的基本原理層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過
2、固定相，稱為流動相）體系中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達到分離的目的。如鹽析（粗分級分離）向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽[（NH4)2SO4，Na2SO4，Na2SO4]，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析。凡鹽析所獲得的粗制蛋白質(zhì)（如鹽析得到的IgG）中均含有硫酸銨等鹽類，將影響以后的純化，所以純化前均應(yīng)除去，此過程稱為“脫鹽”（desalthing）。脫鹽常用透析法和凝膠過濾法。大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)（功能有關(guān)），有高度的生物活性。常用的柱層析方法有葡聚糖凝膠柱層析（分子篩層析）、離子交換層析、吸附層析、親和層析等。一、實驗?zāi)康模?）掌握葡聚糖凝膠柱層析法脫
3、鹽分離蛋白質(zhì)的原理 （2）學(xué)會葡聚糖凝膠柱層析法脫鹽和分離蛋白質(zhì)實驗操作技術(shù)凝膠過濾層析技術(shù)二、基本原理當(dāng)生物大分子通過裝有凝膠顆粒的層析柱時，根據(jù)它們分子大小不同而進行分離的技術(shù)。凝膠層析（gelchromatography）又稱為凝膠過濾（gelfiltration）、分子篩過濾（molecularsievefiltration）等。它是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一種層析技術(shù)。其基本原理是利用被分離物質(zhì)分子大小不同及固定相（凝膠）具有分子篩的特點，將被分離物質(zhì)各成分按分子大小分開，達到分離的方法。凝膠是由膠體粒子構(gòu)成的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。網(wǎng)眼里吸滿水后凝膠膨脹呈柔軟而富于彈性的半固體狀態(tài)。人工
4、合成的凝膠網(wǎng)眼較均勻地分布在凝膠顆粒上有如篩眼，小于篩眼的物質(zhì)分子均可通過，大于篩眼的物質(zhì)分子則不能，故稱為“分子篩”。小于篩眼的分子將完全滲入凝膠網(wǎng)眼，并隨著流動相的移動沿凝膠網(wǎng)眼孔道移動，從一個顆粒的網(wǎng)眼流出，又進入另一顆粒的網(wǎng)眼，如此連續(xù)下去，直到流過整個凝膠柱為止，因而流程長、阻力大、流速慢；大于篩眼的分子則完全被篩眼排阻而不能進入凝膠網(wǎng)眼，只能隨流動相沿凝膠顆粒的間隙流動，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出層析柱；小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能進入或完全滲入凝膠篩眼之間的物質(zhì)分子，則居中流出。這樣被分離物質(zhì)即被按分子的大小分開。完全排阻完全滲入居中流出這是由葡萄糖的
5、多聚物與1–氯–2、3–環(huán)氧丙烷交連而成。環(huán)氧丙烷引入丙三醇基將鏈狀的多聚葡萄糖單位交聯(lián)起來，凝膠網(wǎng)眼的大小由多聚葡萄糖的分子和環(huán)氧丙烷的比例（交聯(lián)度）來控制。交聯(lián)葡聚糖凝膠（商品名為Sephadex)常以G–10至G–200號碼標(biāo)記G：反應(yīng)凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度等G后面的數(shù)字是其吸水量（毫升水/克干膠）乘以10所得的值。如G–25即表示吸水量為2.5ml/1g干膠。市售有G–10、G–25、G–50、G–75、G–100、G–150、G–200等型號。G–75以上的膠因吸水量大，膨脹后形態(tài)柔軟易變，統(tǒng)稱為軟膠。G–75以下的稱為硬膠。葡聚糖凝膠可分離的分子大小從幾百到數(shù)十萬。一般說Sep
6、hadexG-l0～15通常用于分離肽及“脫鹽”。SephadexG–75～200用以分離各類蛋白質(zhì)。凝膠層析是一種物理分離法。葡聚糖凝膠基本上不帶電荷呈多惰性，不與被分離物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，所以分離的效果較好。三、操作1.凝膠溶脹（凝膠的用前處理）商品葡聚糖凝膠為干燥顆粒。使用前必須水化溶脹，凝膠溶脹有兩種方法：一種是將所需葡聚糖凝膠浸入蒸餾水中于室溫下溶脹；另一種是置于沸水浴中溶脹。各種葡聚糖凝膠在上述溶脹方法中所需的時間見下表：型號溶脹時間（室溫，h）沸水?。╤）分離范圍（蛋白質(zhì)，Mr）G–25621000~5000G-50621500~30000G-752433000~70000G-100
7、4854000~1500000目前多用“熱法”溶漲，這樣可大大加速溶漲平衡，通常1—2h即可完成。“熱法”溶漲還可以消毒，殺滅凝膠中污染的細菌，同時也排除了凝膠內(nèi)的汽泡?？梢?，不同類型的各種凝膠溶漲所需的最少時間是不相同的，請參考有關(guān)的技術(shù)數(shù)據(jù)。 在凝膠溶漲的處理過程中，不能進行劇烈攪拌，禁止使用電磁攪拌器，以為這樣會使凝膠顆粒破裂而產(chǎn)生碎片。2.裝柱將層析劑裝入柱中進行層析的方法稱柱層析法。作層析用的柱子稱
