熒光實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)老年人外周血淋巴細(xì)胞β和β腎上腺素能受體基因mrna表達(dá)_論文

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1、熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)老年人外周血淋巴細(xì)胞β1和β2腎上腺素能受體基因mRNA表達(dá)【摘要】目的建立熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)老年人外周血淋巴細(xì)胞β1和β2腎上腺素能受體(AR)基因mRNA表達(dá)。方法隨機(jī)選擇ASAⅠ～Ⅱ級(jí)老年患者30例，分離外周靜脈血淋巴細(xì)胞，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)β1和β2AR基因mRNA表達(dá)，并與半定量PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果30例患者外周血淋巴細(xì)胞熒光實(shí)時(shí)定量PCR均檢出β1和β2ARmRNA表達(dá)，不同性別組同一基因表達(dá)量無(wú)顯著差異（P>）；熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)β2ARmRNA表達(dá)量顯著高于β1AR

2、mRNA(P【關(guān)鍵詞】熒光實(shí)時(shí)定量PCRβ腎上腺素能受體mRNA淋巴細(xì)胞老年人　Abstract：ObjectiveToestablisharealtimequantatitivepolymerasechainreaction(PCR)methodforthedetectionofβ1andβ2ARmRNAexpressioninelderlypatients’peripherallymphocytes.MethodsThirtyelderlypatientswithASAgradeⅠ-Ⅱwererecruited.Theirblo

3、odwascollectedandthelymphocteswereisolated.Theexpressionsofβ1andβ2ARmRNAweredetected10/10withfluorescentquantitativerealtimePCRandsemiquantitivewereexpressionsofβ1andβ2ARmRNAinallthesubjectswithrealtimePCR,andthelatterwassignificallymoreabundantthantheformer(P).Wit

4、hsemiquantivePCR,theratioofβ2ARmRNA/β1ARmRNAdecreasedwhenthecyclesincreased(PKeywords：realtimepolymerasechainreaction(PCR);βadrenergicreceptor;lymphocyte;elderlypatient人外周血淋巴細(xì)胞與心肌細(xì)胞表面βAR密度成顯著正相關(guān)［1］。以淋巴細(xì)胞為模型，間接反應(yīng)各種病理生理狀態(tài)下心肌細(xì)胞βAR表達(dá)變化，被多數(shù)研究所證實(shí)。然而，淋巴細(xì)胞βAR亞型分布存在較大爭(zhēng)議：早期

5、研究認(rèn)為，淋巴細(xì)胞僅表達(dá)β2AR［2］。最新研究發(fā)現(xiàn)，人外周血淋巴細(xì)胞存在β1、β2和β3AR三種亞型，且β1和β2ARmRNA豐度相近［3］。既往檢測(cè)淋巴細(xì)胞βAR基因表達(dá)多采用半定量PCR，該方法屬終點(diǎn)檢測(cè)法，比較目的基因起始拷貝量準(zhǔn)確度較低。本研究采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR，檢測(cè)老年人外周血淋巴細(xì)胞β1和β2AR基因mRNA表達(dá)，并與半定量PCR結(jié)果比較?！　?材料與方法試驗(yàn)對(duì)象10/10隨機(jī)選擇擬全麻下行擇期手術(shù)的老年患者30例，其中男、女各15例，年齡65~80歲（平均歲），ASAⅠ~Ⅱ級(jí)，既往無(wú)心血管系統(tǒng)及血液系統(tǒng)疾病。

6、主要試劑及儀器人淋巴細(xì)胞分離液（美國(guó)Sigma公司）、TrizolTMRNAIsolationReagent(美國(guó)Invitrogen公司)，、ReverseTranscriptionSystem(美國(guó)Promega公司)，SYBRGreen(日本Takara公司)。BIORADiCycleriQMuhicolorRealtimePCRDetectionSystem(美國(guó)BioRad公司)；GeneAmpPCRSystem2400(美國(guó)ABI公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)；DNA電泳儀(Hoefer公司)；Fluo

7、rS凝膠成像儀(美國(guó)BioRad公司)；紫外分光光度計(jì)UV240(日本)。引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)NCBIGenbank中人類β1AR、β2AR和βactinmRNA全長(zhǎng)序列（登錄號(hào)：NM000684、NM000024和NM001101）采用Primer3軟件(http：///cgibin/primer3/primer3www．cgi)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物合成后用超純水溶解，每條引物濃度均為20μmol，等比例混合后-20℃保存?zhèn)溆?。?β1AR、β2AR、actincDNA的引物序列

8、（略）10/10總RNA提取與cDNA合成外周血淋巴細(xì)胞分離術(shù)晨8：00~9：00抽取所選病例靜脈肝素抗凝血5ml，Boyum法分離淋巴細(xì)胞（參照人淋巴細(xì)胞分離液使用說(shuō)明）。1×PBS液調(diào)整細(xì)