pcr常見問題分析及對策

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1、PCR常見問題分析及對策(無擴(kuò)增產(chǎn)物、非特異性擴(kuò)增、拖尾、假陽性)問題1：無擴(kuò)增產(chǎn)物現(xiàn)象：正對照有條帶，而樣品則無原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer對樣品不合適3.引物設(shè)計不當(dāng)或者發(fā)生降解4.反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時間太短對策:1.純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更換Buffer或調(diào)整濃度3.重新設(shè)計引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物4.降低退火溫度、延長延伸時間問題2：非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象：條帶與預(yù)計的大小不一致或者非特異性擴(kuò)增帶原因：1.引物特異性差2.模板或引物濃度過高3.酶量過多4.Mg2+濃

2、度偏高5.退火溫度偏低6.循環(huán)次數(shù)過多對策：1.重新設(shè)計引物或者使用巢式PCR2.適當(dāng)降低模板或引物濃度3.適當(dāng)減少酶量4.降低鎂離子濃度5.適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法6.減少循環(huán)次數(shù)問題3：拖尾現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。原因：1.模板不純2.Buffer不合適3.退火溫度偏低4.酶量過多5.dNTP、Mg2+濃度偏高6.循環(huán)次數(shù)過多對策：1.純化模板2.更換Buffer3.適當(dāng)提高退火溫度4.適量用酶5.適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度6.減少循環(huán)次數(shù)問題4：假陽性現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物原因：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交*污染對策：1.操作時

3、應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；2.除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。3.各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存??PCR引物設(shè)計的黃金法則（轉(zhuǎn)自tiangen）1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計。DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)2.引物長度一般在15~30堿基之間。引物長度（primerlength）常用的是18-27bp，但

4、不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。3.引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。GC含量（composition）過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。4.引物3′端要避

5、開密碼子的第3位。如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴(kuò)增的特異性與效率。5.引物3′端不能選擇A，最好選擇T。引物3′端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3′端最好選擇T。6.堿基要隨機(jī)分布。引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯誤引發(fā)（Falsepriming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最

6、好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。7.引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）使引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤其應(yīng)避免3′端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體（Dimer與Crossdimer）的形成。引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應(yīng)盡量使其△G值不要過高（應(yīng)小于4.5kcal/m

7、ol）。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行。8.引物5′端和中間△G值應(yīng)該相對較高，而3′端△G值較低?！鱃值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性，△G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5′端和中間△G值相對較高，而3′端△G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3′端的△G值過高，容易在錯配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。（不同位置的△G值可以用Oligo6軟件進(jìn)行分析）9.引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。引物的5′端決定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被

8、修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′端修