氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)的研究進(jìn)展

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1、氨基酸的研究進(jìn)展摘要 由于氨基酸在食品、飼料、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和日用化工等方面有極其廣泛的用途,尤其隨著抗癌藥物制劑、氨基酸輸液制劑及甜味二肽生產(chǎn)的飛速發(fā)展,對(duì)原料氨基酸的需求量日益增長(zhǎng)。傳統(tǒng)的發(fā)酵工業(yè)越來(lái)越不能滿足需求,勢(shì)必被以基因工程為基礎(chǔ)的新興發(fā)酵工業(yè)所代替。通過(guò)對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸的歷史進(jìn)行回顧,及對(duì)未來(lái)前景作出展望,指出了運(yùn)用DNA重組、定向突變等手段,對(duì)代謝途徑及關(guān)鍵酶進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究的必要性。關(guān)鍵詞 發(fā)酵法 氨基酸生產(chǎn) 基因工程3.1 載體-受體系統(tǒng)及克隆表達(dá)的研究3.1.1 受體的獲得目前使用的氨基酸工程菌受體主要是大

2、腸桿菌K-12及棒狀桿菌家族,通常是通過(guò)誘變選育出的基礎(chǔ)產(chǎn)率較高的菌株。大腸桿菌遺傳背景研究得清楚,載體系統(tǒng)完善,利于工程菌的構(gòu)建,但它含有內(nèi)毒素且不能將蛋白產(chǎn)物分泌至胞外,為應(yīng)用帶來(lái)困難。棒狀桿菌能克服這兩個(gè)缺點(diǎn),但載體受體系統(tǒng)研究較晚且有限制修飾系統(tǒng)的障礙,所以獲得利于外源基因?qū)爰氨磉_(dá)且能穩(wěn)定遺傳的受體菌是尚待解決的問(wèn)題。有報(bào)道表明,可通過(guò)給目的基因加上前導(dǎo)肽,使蛋白產(chǎn)物分泌至胞外;可對(duì)受體菌加熱處理,暫時(shí)抑制其限制修飾系統(tǒng)[1]。3.1.2 載體的構(gòu)建有效的載體需要有在受體菌中可啟動(dòng)的復(fù)制起始位點(diǎn),這可從棒狀桿菌家族內(nèi)源小

3、質(zhì)粒中獲得[2];載體所需的篩選標(biāo)記及外源基因插入的多克隆位點(diǎn),可從常用的克隆載體中獲得。在此基礎(chǔ)上,引入tacP/lacIQ系統(tǒng),得到能靠IPTG濃度來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的載體;為了利于尋找有啟動(dòng)子活性的序列,引入lacZ基因,構(gòu)建了啟動(dòng)子探測(cè)載體[3];通過(guò)引入mob基因,得到了可移動(dòng)載體,可將攜帶的外源基因以同源重組的方式與染色體整合[4]。3.1.3 基因轉(zhuǎn)移手段由于棒狀桿菌是革蘭氏陽(yáng)性菌,CaCl2轉(zhuǎn)化法對(duì)它不適用,通常采用的方法有:原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo),電轉(zhuǎn)化,接合轉(zhuǎn)移。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法是較早采用的方法,由于受到原生質(zhì)體再生

4、條件的局限,效率不高;電轉(zhuǎn)化方法由于高效,快速被廣泛使用,目前它的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的100~1000倍[5]。接合轉(zhuǎn)移這種傳統(tǒng)的重組方法近年來(lái)由于可移動(dòng)載體的應(yīng)用而發(fā)展,可用于基因在親緣關(guān)系遠(yuǎn)的物種之間的轉(zhuǎn)移,并且可將外源基因整合于染色體上,易于穩(wěn)定遺傳[6]。3.2 氨基酸生物合成途徑的研究想要培育出某種氨基酸的產(chǎn)生菌,首先要了解這種氨基酸的生物合成途徑、關(guān)鍵酶的反饋調(diào)控機(jī)制,考慮解除的方法,從而設(shè)計(jì)正確的育種方案。3.2.1 共同途徑代謝途徑可分為共同途徑和分支途徑。共同途徑為分支途徑提供前體物質(zhì)。對(duì)共同途徑的研究

5、的焦點(diǎn)在于代謝過(guò)程的關(guān)鍵分支點(diǎn)。根據(jù)現(xiàn)有的研究資料,EP是各個(gè)酶系統(tǒng)競(jìng)爭(zhēng)的對(duì)象[7]。丙酮酸激酶將PEP轉(zhuǎn)化為丙酮酸,PEP羧化酶、PEP羧激酶將PEP和CO2轉(zhuǎn)化為草酰乙酸;DAHP合成酶將PEP與4-磷酸赤蘚糖合成DAHP。目前對(duì)代謝途徑的研究,主要是通過(guò)插入法取代某些基因,或使酶基因失活,從而研究基因產(chǎn)物的功能。Gulber等在研究PYK的功能時(shí),根據(jù)其N端序列合成PCR引物,擴(kuò)增得到PYK基因內(nèi)部片段,用可移動(dòng)質(zhì)粒PSU301導(dǎo)入棒桿菌中同源重組,得到PYK突變體,來(lái)研究PYK基因的功能。locatedintheTomb,

6、DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcame3.2.2 分支途徑分支途徑通過(guò)若干個(gè)酶系,將共同的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為不同的氨基酸。途徑的研究熱點(diǎn)在于關(guān)鍵酶的克隆與調(diào)控。參與氨基酸發(fā)酵的關(guān)鍵酶主要有12個(gè),每個(gè)分支途徑都有

7、一到數(shù)個(gè)關(guān)鍵酶,生物合成的途徑越長(zhǎng),關(guān)鍵酶的數(shù)目越多。關(guān)鍵酶中有的是變構(gòu)酶,有的是同功酶,也有的多功能酶,它們?cè)谟谟赏磺绑w出發(fā)去合成多種氨基酸的關(guān)鍵點(diǎn)上。目前,許多關(guān)鍵酶的基因已被克隆:Ozaki等克隆了谷氨酸棒桿菌的分支酸變位酶和預(yù)苯酸脫水酶基因,通過(guò)質(zhì)粒載體導(dǎo)回谷氨酸棒桿菌,產(chǎn)量提高了50%[8]。Katsumata克隆了谷氨酸棒桿菌的阿拉伯庚酮糖酸合成酶基因,使色氨酸的產(chǎn)量提高了54%[9]。3.3 酶調(diào)控方面進(jìn)展3.3.1 酶量的調(diào)控酶量的調(diào)控也可視為酶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控,在產(chǎn)氨基酸途徑上的關(guān)鍵酶的表達(dá),受到調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物與代

8、謝終產(chǎn)物的共同影響。誘導(dǎo)物利于酶在濃度高時(shí)的合成,而阻遏物抑制酶的合成。Yang等對(duì)TyrR基因的研究表明,它是一個(gè)調(diào)節(jié)基因,調(diào)控著大腸桿菌中8個(gè)轉(zhuǎn)錄單位的·21·氨基酸和生物資源闡明氨基酸生物合成系統(tǒng)調(diào)節(jié)機(jī)制的基礎(chǔ)上發(fā)展為營(yíng)養(yǎng)缺陷變異株、抗藥性菌

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