RNA干擾沉默EZH2基因?qū)θ税螂装〦J細(xì)胞增殖的影響.doc

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1、RNA干擾沉默EZH2基因?qū)θ税螂装〦J細(xì)胞增殖的影響【摘要】目的：研究RNA干擾沉默EZH2基因?qū)θ税螂装〦J細(xì)胞周期和增殖的影響.方法：體外構(gòu)建EZH2基因的shRNA的表達(dá)載體，Lipofectamin2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染膀胱癌EJ細(xì)胞，采用RTPCR和WesternBlot方法檢測(cè)特異性shRNA對(duì)EZH2基因沉默效果，轉(zhuǎn)染后采用MTT法檢測(cè)shRNA對(duì)細(xì)胞增殖的作用；應(yīng)用PI單染流式細(xì)胞術(shù)分析對(duì)細(xì)胞周期的改變.結(jié)果：EZH2基因的shRNA表達(dá)載體有效下調(diào)EZH2基因的表達(dá)（P<0.05）.與對(duì)照組比較，細(xì)胞增殖明顯抑制（P<0.05）；同時(shí)引起細(xì)胞G1

2、期阻滯，RNA干擾后,G1期細(xì)胞增加［(84.0±8.7)%vs(52.0±6.8)%,P<0.05］，S期細(xì)胞減少［（11.0±1.1）%vs（43.0±4.9）%,P<0.05］.結(jié)論：EZH2基因有望成為應(yīng)用RNAi技術(shù)探索膀胱癌基因治療的潛在靶基因.【關(guān)鍵詞】膀胱腫瘤EZH2基因RNA干擾細(xì)胞增殖細(xì)胞周期　　0引言　　EZH2基因(enhancerofzesthomolog2,EZH2)是多梳基因家族（polycombgroup，PcG）的主要成員，與果蠅zeste基因增強(qiáng)子是同源基因.在胚胎發(fā)育早期普遍存在，其高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展

3、［1］.有研究［2］顯示，EZH2基因在膀胱癌組織表達(dá)增加，與浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但作用機(jī)制還不明確.本研究以EZH2基因?yàn)榘悬c(diǎn),設(shè)計(jì)構(gòu)建其短發(fā)夾狀RNA的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染膀胱癌EJ細(xì)胞，觀察EZH2基因?qū)Π螂装┘?xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響并探討其作用機(jī)制，為膀胱癌基因治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).　　1材料和方法　　1.1材料人膀胱癌EJ細(xì)胞由天津泌尿外科研究所保存.Lipofectamine2000，RNA提取純化試劑TRIzol（美國(guó)Invitrogen公司）；RTPCR試劑盒，質(zhì)粒DNA提取試劑盒（北京博大泰克生物制品公司）；抗人EZH2多克隆抗體，SP試劑盒，DAB顯色試劑盒（深

4、圳晶美生物工程有限公司）.　　1.2方法　　1.2.1EZH2基因shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)文獻(xiàn)［3］的方法，選擇EZH2mRNA的461~481bp之間的核苷酸序列AAGACTCTGAATGCAGTTGCT為RNA干擾的靶序列，體外合成兩端帶有BamHⅠ和HindⅢ粘端酶切位點(diǎn)，內(nèi)含5′AAGACTCTGAATGCAGTTGCTTTCAAGAGAAGCAACTGCATTCAGAGTCTT3′發(fā)夾狀序列的雙鏈DNA,將合成的片段接入pRNAT載體,轉(zhuǎn)染DH5α大腸桿菌，篩選、擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功，稱之為EZH2shRNA；同時(shí)構(gòu)建陰性表達(dá)質(zhì)粒,稱之為EZH2s

5、crambled.5　　1.2.2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染復(fù)蘇的膀胱癌EJ細(xì)胞置事先加含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基的100mm培養(yǎng)皿中，37℃，50mL/LCO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，常規(guī)更換培養(yǎng)液、傳代.實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均使之處于狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期.轉(zhuǎn)染前1d按試驗(yàn)要求將所需密度的細(xì)胞接種6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞達(dá)到所需融合率時(shí)在無(wú)血清的DMEM環(huán)境中轉(zhuǎn)染，操作步驟按Lipofectamin2000說(shuō)明書進(jìn)行.實(shí)驗(yàn)分為：轉(zhuǎn)染EZH2shRNA質(zhì)粒為RNA干擾組；轉(zhuǎn)染EZH2scrambled為陰性質(zhì)粒組；未轉(zhuǎn)染的EJ細(xì)胞為對(duì)照組.　　1.2.3RTPCR檢測(cè)EJ細(xì)胞EZH2基因

6、mRNA表達(dá)轉(zhuǎn)染后48h后，收集各實(shí)驗(yàn)組EJ細(xì)胞約1×107，提取細(xì)胞總RNA.取5μg總RNA，加入1μL由16個(gè)脫氧胸苷酸堿基組成的寡核苷酸Oligo（Dt）16，按說(shuō)明書操作合成cDNA的第一鏈，然后進(jìn)行PCR反應(yīng).GAPDH為內(nèi)參照.引物的序列為EZH2（289bp）:上游：5′GTGGAGAGATTATTTCTCAAGATG3′，下游：5′CCGACATACTTCAGGGCATCAGCC3′;GAPDH引物(492bp):上游:5′TGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGG3′，下游：5′CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC3′

7、,反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性50s，52℃退火50s，72℃延伸1min.各取10μL反應(yīng)產(chǎn)物，12g/L瓊脂糖凝膠電泳，ImageMasterTotalLab軟件進(jìn)行條帶分析，以EZH2與GAPDH條帶的積分吸光度比值表示EZH2mRNA的表達(dá)變化.　　1.2.4WesternBlot檢測(cè)EJ細(xì)胞EZH2基因蛋白表達(dá)抗體為1∶1000稀釋的EZH2抗兔人多克隆抗體，二抗為1∶200稀釋的生物素標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體，DAB顯色.SDSPAGE電泳、轉(zhuǎn)膜采用常規(guī)方法，βactin作為內(nèi)參照.檢