Midkine mRNA在食管鱗癌患者外周血中的表達及其臨床意義.doc

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1、MidkinemRNA在食管鱗癌患者外周血中的表達及其臨床意義作者：胡俊,田小強,商延芳,劉飛,劉全俊,黃培林【摘要】目的:探討靶基因中期因子(MK)在食管鱗癌患者外周血中的表達及其與食管鱗癌生物學行為的關(guān)系。方法:采用巢式RTPCR方法檢測54例食管鱗癌患者外周血的MKmRNA。10例正常健康志愿者外周血為陰性對照，11例食管鱗癌腫瘤組織為陽性對照。結(jié)果:54例食管鱗癌患者外周血MKmRNA陽性率為61.11%(33/54)，并與食管鱗癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性(P<0.05)，而健康成人外周血則無一例出現(xiàn)陽性。結(jié)論:應用巢式RTPCR方法檢測食管癌

2、患者外周血中的MKmRNA具有較高的敏感性和特異性，它有望成為判斷食管鱗癌惡性程度、轉(zhuǎn)移、復發(fā)和監(jiān)測療效的客觀指標?！娟P(guān)鍵詞】中期因子;食管鱗癌;外周血;腫瘤標志物;生物學行為研究表明，惡性腫瘤在侵襲和轉(zhuǎn)移的早期階段就有癌細胞入血，即微轉(zhuǎn)移（micrometastasis），它是腫瘤的惡性標志和主要特征之一，也是導致治療失敗和患者死亡的主要原因之一。因此，早期診斷腫瘤微轉(zhuǎn)移是提高惡性腫瘤治療效果、改善患者預后的有效途徑之一[12]。而巢式RTPCR可在1×107個單個核細胞中檢出1～10個腫瘤細胞，其敏感性、特異性遠高于其他方法[3]。迄今為止，國內(nèi)外尚未見食

3、管鱗癌患者外周血中期因子(midkine，MK)mRNA表達情況的研究報道。本研究擬用巢式RTPCR方法檢測食管鱗癌患者外周血的MKmRNA表達，并探討其與食管鱗癌生物學行為的關(guān)系。　　1材料與方法　　1.1材料　　1.1.1樣本54例食管鱗癌患者均為東南大學附屬中大醫(yī)院胸外科2004~2006年的住院患者，所有病例均經(jīng)病理確診；男40例，女14例；年齡46～83歲，平均63.4歲。取術(shù)前患者外周血3ml。以11例食管鱗癌腫瘤組織標本為陽性對照，10例健康志愿者外周血為陰性對照。　　1.1.2試劑淋巴細胞分離液和DEPC為南京生興生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，Trizo

4、l試劑、RTPCR試劑盒及Taq酶等為日本TaKaRa公司產(chǎn)品?！　?.1.3引物參照有關(guān)文獻，采用Primer5引物設(shè)計軟件自行設(shè)計，所有引物均由江蘇百龍基因有限公司合成。引物序列見表1。　　表1βactin和MK基因的引物序列（略）5　　Tab1PrimersequencesofβactinandMK　　1.2方法　　1.2.1樣本處理及總RNA提取抽取術(shù)前患者外周靜脈血3ml，以枸櫞酸鈉抗凝，用淋巴細胞分離液按密度梯度離心法常規(guī)分離單個核細胞。腫瘤組織以勻漿器研碎得細胞懸液。Trizol一步法分別提取總RNA20μl，將提取的RNA于紫外分光光度計上定

5、量，并行10%瓊脂糖凝膠電泳，以明確RNA未降解。　　1.2.2逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA和PCR擴增所有標本各取5μlRNA，70℃6min變性，根據(jù)TaKaRaRNA試劑盒進行cDNA第1鏈合成，行MK巢式PCR。第1輪PCR：取cDNA5.0μl，10×PCRbuffer2.5μl，25mmol·L－1MgCl20.5μl，10mmol·L－1dNTP0.5μl，10pmol·L－1第1輪PCR上、下游引物各2.5μl，TaqDNA聚合酶1.25U，加滅菌水至25μl。反應條件：94℃5min預變性；94℃30s，60℃30s，72℃60s，30個循環(huán)；72℃5m

6、in延伸。第2輪PCR：取第1輪PCR產(chǎn)物2.0μl作模板，加10pmol·L－1第2輪PCR上、下游引物各2.5μl，除退火溫度改為53℃外，余反應體系及反應條件同前。選擇βactin基因作為內(nèi)參照質(zhì)控指標。PCR反應中加入其上、下游引物各2.5μl，擴增條件除退火溫度改為56℃外，余反應體系及反應條件同前，但只進行1輪擴增?！　?.2.3RTPCR產(chǎn)物鑒定將第1輪PCR產(chǎn)物雙向測序，并取第2輪MKPCR產(chǎn)物及βactinPCR產(chǎn)物各5μl加樣于1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓80V，電泳約25min，然后用紫外光凝膠成像系統(tǒng)掃描并拍照。在相應位置(531

7、、272bp)出現(xiàn)肉眼可見條帶判為陽性(圖1)。MK產(chǎn)物帶272bp，βactin產(chǎn)物帶531bp　　M.Marker；1.腫瘤組織陽性對照；2.健康捐獻者外周血陰性對照；3～7.患者外周血　　圖13種標本PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳示例（略）　　Fig1ExampleofthreekinesofPCRproductsseparatedbygelelectrophoresis　　1.3統(tǒng)計學處理用SPSS軟件分析各組數(shù)據(jù)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。　　2結(jié)果　　2.1MKmRNA測序結(jié)果PCR產(chǎn)物采用上、下游引物進行雙向測序，結(jié)果如下：5′ATGCAG

8、CACCG