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1、TCDD對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的研究進(jìn)展作者：李萬芳，靳洪濤，王愛平摘要】二惡英具有致癌、致畸作用以及心血管神經(jīng)內(nèi)分泌毒性，近幾年研究發(fā)現(xiàn)二惡英的胎盤毒性是其導(dǎo)致宮內(nèi)死亡的重要原因。TCDD是二惡英類化合物中毒性最強(qiáng)的一種。TCDD對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育毒性有了較全面和深入的認(rèn)識(shí)，對(duì)闡明TCDD對(duì)人類胚胎發(fā)育毒性有重要意義?！娟P(guān)鍵詞】2，3，7，8-四氯二苯并對(duì)二惡英（TCDD）；斑馬魚；胚胎發(fā)育毒性自我國加入《關(guān)于持久性有機(jī)污染物的斯德哥爾摩公約》，簡稱《POPs公約》，人們對(duì)環(huán)境持久性污染物（POPs）的認(rèn)識(shí)不斷加強(qiáng)，有關(guān)二惡英（Dioxin）的研究也
2、受到重視。除皮膚毒性、生殖毒性、免疫毒性、致癌性之外，二惡英的胎盤毒性尤為引人注目［1］。其中，2,3,7,8－四氯二苯并對(duì)二惡英（2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，簡稱TCDD）毒性最強(qiáng)，同時(shí)也是研究最徹底的，因此常常用TCDD這個(gè)稱呼來代替二惡英類化合物。TCDD對(duì)猴、兔、豚鼠、大鼠、小鼠、雞的毒性研究較多，魚類也是TCDD的敏感生物之一，特別是在胚胎期［2］。斑馬魚（Daniorerio）是屬于輻鰭亞綱（Actinopterygii）鯉科（Cyprinidae）短擔(dān)尼魚屬（Danio）的一種硬骨魚。198
3、1年，Streisinger等報(bào)道了斑馬魚的體外受精及單倍體誘導(dǎo)技術(shù)，建立了純合品系，并介紹了斑馬魚的第一個(gè)自然突變體-golden，至今已證明斑馬魚是適合用于飽和誘變的唯一的脊椎動(dòng)物。目前斑馬魚、人、小鼠是生命科學(xué)研究中三種主要的模式脊椎動(dòng)物?！ ?斑馬魚作為胚胎發(fā)育毒性研究模式生物的優(yōu)勢首先，斑馬魚是脊椎動(dòng)物，心血管、血液、消化道、肝臟、腎臟以及視覺系統(tǒng)與人類相應(yīng)系統(tǒng)有許多共同特點(diǎn)。斑馬魚的基因組中含有約30000個(gè)基因，這個(gè)數(shù)目與人差不多，而且它的許多基因與人體存在相應(yīng)關(guān)系。其次，斑馬魚還具以下獨(dú)特優(yōu)勢：成年魚個(gè)體小，易于飼養(yǎng)；常年產(chǎn)卵，成熟
4、的雌魚每隔1周可產(chǎn)幾百枚卵；卵在體外受精、發(fā)育，對(duì)母體無任何影響；從受精卵發(fā)育到完整的胚胎形成只需24h。又由于胚胎完全透明，可視性好，即使在發(fā)育的高級(jí)階段，仍然可以觀察到全部的細(xì)胞，熒光染色或使用其他標(biāo)記物可使細(xì)胞系觀察得更清楚［3］。研究者不僅能跟蹤觀察每個(gè)細(xì)胞的發(fā)育命運(yùn)，也可觀察到原腸期的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、腦區(qū)形成和心跳等胚胎發(fā)育情況［4］，同時(shí)發(fā)育異常的突變體也很容易被鑒別出來［5］?，F(xiàn)對(duì)于斑馬魚的研究已經(jīng)成功地發(fā)展了突變技術(shù)，建立了斑馬魚遺傳圖譜，分析了有價(jià)值的突變體，成功地發(fā)展了轉(zhuǎn)基因斑馬魚技術(shù)，這些都成為毒理學(xué)研究的優(yōu)良資源。8另外，斑馬魚的
5、胎心類似于人胚胎的心臟，分為心房和心室，房室之間有瓣膜。斑馬魚特別適合于心血管系統(tǒng)的研究，因?yàn)樵诨畹聂~卵中，心臟明顯的形態(tài)和功能缺陷能用肉眼直接觀察到，較細(xì)微的差別可通過分子標(biāo)記物來識(shí)別。而且斑馬魚仔魚早期生存不依賴于血液循環(huán)［6］，這為觀察心血管系統(tǒng)異常發(fā)育的發(fā)展過程提供了一個(gè)極好的模型?！ ?TCDD對(duì)斑馬魚的胚胎毒性2.1致死性董武、魏強(qiáng)等報(bào)道24hpf（受精后24h）染毒至180hpf，攝食對(duì)照群，0.1μg/L，0.3μg/L，0.5μg/L，1μg/L，10μg/L染毒群的死亡率分別是0，0，5%，60.2%，61.8%，100%。10
6、μg/L染毒群在144hpf已全部死亡［7］。這種試驗(yàn)條件下180hpf的LC50約為0.3～0.5μg/L。Henry等測定240hpf的LC50為2.5ngTCDD/gegg［8］。使用6ng/mlTCDD（4hpf）染毒，144hpf開始出現(xiàn)死亡，240hpf全部死亡，雖然推遲至96hpf染毒能避免心血管缺陷的出現(xiàn)，但并不能避免致死現(xiàn)象［9］?？梢姡琓CDD引起的致死性不依賴于心血管毒性。2.2下頜發(fā)育短小斑馬魚下頜發(fā)育短小已成為TCDD引起的典型毒性之一［10～14］。24hpf開始對(duì)斑馬魚胚胎持續(xù)靜態(tài)染毒至觀察結(jié)束，1ppb染毒群在60h
7、pf引發(fā)下頜生長的顯著（P<0.05）抑制，且作用強(qiáng)度與TCDD濃度正相關(guān)的［10］。對(duì)下頜與身長的比值進(jìn)行研究，證明TCDD的對(duì)下頜的抑制作用是特異的，不是繼發(fā)于對(duì)胚胎發(fā)育的抑制。軟骨染色觀察顯示TCDD能顯著抑制頭部軟骨的生長，特別是Meckel’s軟骨，但并不影響軟骨的形成。為了確定TCDD對(duì)胚胎的作用時(shí)間，分別在0，12，24，36，48，60，72，84hpf開始染毒，96hpf觀察對(duì)下頜發(fā)育的影響。0～24hpf染毒對(duì)下頜抑制的程度無明顯區(qū)別，隨后24～84hpf染毒對(duì)下頜的抑制作用逐漸降低?？梢娪?4hpf完成的神經(jīng)嵴細(xì)胞的分化
8、過程［15］不是TCDD產(chǎn)生下頜短小毒性的關(guān)鍵時(shí)期（criticalperiod）。盡管軀干血液循環(huán)顯著降低，但直到下頜生
