醫(yī)藥學(xué)藥學(xué)畢業(yè)論文 核酸擴(kuò)增技術(shù)在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用與進(jìn)展

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1、湖南師范大學(xué)本科畢業(yè)論文考籍號：XXXXXXXXX姓名：XXX專業(yè)：醫(yī)藥學(xué)藥學(xué)論文題目：核酸擴(kuò)增技術(shù)在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用與進(jìn)展指導(dǎo)老師：XXX二〇一一年十二月十日　　近10余年來現(xiàn)代分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，為臨床實(shí)驗(yàn)室診斷提供了較為可靠的核酸檢測方法。經(jīng)典聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增技術(shù)已廣泛應(yīng)用于結(jié)核病的診斷；然而，由于污染問題嚴(yán)重，擴(kuò)增抑制物的存在，試劑盒缺乏規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化，加之技術(shù)、條件、質(zhì)控等方面因素影響，其敏感性、特異性差異頗大，人們對其可信度、可靠性產(chǎn)生了懷疑，給臨床醫(yī)生診斷結(jié)核病帶來了一定的困惑。為此，國外學(xué)者開發(fā)出具有高度敏感性、特異性、標(biāo)準(zhǔn)化、商

2、品化的PCR擴(kuò)增試劑盒；繼PCR之后，又發(fā)展了幾種新的核酸體外擴(kuò)增技術(shù)?，F(xiàn)就其在結(jié)核病診斷方面的應(yīng)用與進(jìn)展作一介紹，供廣大同道借鑒?！　∫弧CR為基礎(chǔ)擴(kuò)增反應(yīng)即RocheAmplicor結(jié)核分支桿菌PCR試驗(yàn)(AmplicorpCR)　　AmplicorPCR系應(yīng)用生物素標(biāo)記位于結(jié)核分支桿菌16SrRNA基因中高度保守區(qū)域種特異性引物擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌復(fù)合群DNA中584bp序列；生物素標(biāo)記的擴(kuò)增子(amplicon)與種特異性DNA探針進(jìn)行雜交后，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫技術(shù)進(jìn)行比色鑒定，結(jié)果判斷以450nm波長時吸光度(A450)＞0.350為陽性標(biāo)準(zhǔn)［1～3］。

3、AmplicorpCR是由瑞士Roche公司開發(fā)研制的標(biāo)準(zhǔn)化、商品化試劑盒，該試劑盒有三個不同的小盒：標(biāo)本處理盒、擴(kuò)增盒和鑒定盒。為防止交叉污染，廠商推薦試劑制備、標(biāo)本處理、擴(kuò)增與鑒定應(yīng)三室分開，此外，應(yīng)用尿嘧啶-N-糖基化酶控制擴(kuò)增子攜帶污染。研究表明，AmplicorpCR可檢出少至2～10個結(jié)核分支桿菌中DNA。與培養(yǎng)法相比，AmplicorpCR檢測臨床標(biāo)本中結(jié)核分支桿菌DNA的敏感性為76.7%～97.8%，特異性達(dá)97.7%～99.3%，陽性預(yù)計值(PPV)66%～93%，陰性預(yù)計值(NPV)98%～98.6%［2～4，6］。若參考臨床綜合診斷，其

4、敏感性、特異性、PPV、NPV分別為66.7%～85.4%、99.6%～100%、91.7%～100%、96.8%～98.6%，該方法至少與培養(yǎng)法一樣敏感［1，4～6］。對于涂陽標(biāo)本，AmplicorpCR敏感性(97.6%～98%)顯著高于涂陰標(biāo)本(40%～53%)［4，6］。該方法還可對涂陽標(biāo)本應(yīng)用種特異性探針對結(jié)核分支桿菌和非結(jié)核分支桿菌(MOTT)早期進(jìn)行菌種鑒定［2，4］。AmplicorpCR整個過程僅需7小時左右，用于檢測BACTEC培養(yǎng)基中結(jié)核分支桿菌較核酸探針雜交試驗(yàn)提前4天以上［4］。法國學(xué)者Carpentier等［5］對Amplicorp

5、CR進(jìn)行多中心研究，結(jié)果顯示，其檢測肺外標(biāo)本(尿、胸腹液、腦脊液等)、涂陽標(biāo)本、涂陰標(biāo)本及培陽標(biāo)本的敏感性分別為83%、94.5%、74%、95%，特異性達(dá)98%。AmplicorpCR不僅具有高度敏感性、特異性和可重復(fù)性，而且操作簡單，無需昂貴設(shè)備，無放射性污染問題；然而，其靈敏度較經(jīng)典PCR稍低，可能系標(biāo)本量較少及存在抑制因子所致。AmplicorpCR在方法學(xué)上仍需進(jìn)一步自動化以避免手工重復(fù)操作。　　二、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增反應(yīng)即基因探針擴(kuò)增直接試驗(yàn)(AMTDT)　　AMTDT是由美國加州Gen-Probe公司發(fā)展起來的由DNA介導(dǎo)的等溫rRNA擴(kuò)增法，擴(kuò)增子應(yīng)

6、用吖啶酯(acridinumester,AE)標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光探針(AE-DNA探針)進(jìn)行核酸雜交保護(hù)實(shí)驗(yàn)(hybridizationprotectionassay,HPA)，通過照度計檢測雜交探針的相對發(fā)光值(ralativelightunits,RLU)，以RLU≥3×104判斷為陽性。該rRNA序列在核酸中存在2×103拷貝數(shù)，應(yīng)用AMTDT可使特異性靶rRNA序列擴(kuò)增109倍，其檢測低限為每ml10個［1～3］。由該公司生產(chǎn)的商品化試劑盒應(yīng)用N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)和十二烷基硫酸鈉(SDS)對標(biāo)本進(jìn)行消化與去污染處理，且該過程在單管中進(jìn)行，這樣

7、也防止了標(biāo)本間可能的交叉污染；該試劑盒能直接用于各種臨床標(biāo)本的檢測，整個過程僅需5小時便可完成。與培養(yǎng)法相比，AMTDT檢測臨床標(biāo)本敏感性為92.9%～100%，特異性為90.1%～98.7%；結(jié)合臨床綜合判斷，AMTDT敏感性、特異性、PPV、NPV分別達(dá)83.9%～100%、97.6%～100%、80.7%～100%、96.3%～99.3，其敏感性與培養(yǎng)法相等或稍高［1～3，7，9］。研究表明，AMTDT檢測肺外標(biāo)本(胸腹液，腦脊液)的敏感性和特異性與肺部標(biāo)本大致相仿(P＞0.05)，并不低于培養(yǎng)法；把標(biāo)本量從50μl增加到500μl，然后進(jìn)行離心，可明顯

8、提高該試驗(yàn)結(jié)果的敏感性，而不影響其特異