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1、博士學(xué)位論文中華絨螯蟹造血組織及造血作用機(jī)理的研究作者姓名：賈志浩指導(dǎo)教師:張國(guó)范研究員中國(guó)科學(xué)院海洋研究所學(xué)位類(lèi)別:理學(xué)博士學(xué)科專(zhuān)業(yè):海洋生物學(xué)研究所:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所2018年6月CharacterizationofhematopoietictissueandhematopoieticregulatorymechanismofChinesemittencrabEriocheirsinensisADissertationSubmittedtoTheUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfi
2、llmentoftherequirementForthedegreeofDoctorofPhilosophyByZhihaoJiaDissertationSupervisor:ProfessorGuofanZhangInstituteofOceanology,ChineseAcademyofSciencesJune,2018摘要造血作用是一系列的復(fù)雜過(guò)程，包括不同類(lèi)型的血細(xì)胞從特定的造血位點(diǎn)發(fā)生、發(fā)育以及成熟。造血作用中生成的形態(tài)各異的血細(xì)胞（免疫細(xì)胞），構(gòu)成了機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的核心和基礎(chǔ)，因此了解造血作用中血細(xì)胞的發(fā)生、分化及其相應(yīng)的免疫功能，
3、是探究機(jī)體免疫防御機(jī)制的前提和關(guān)鍵切入點(diǎn)。由于無(wú)脊椎動(dòng)物缺乏適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，它們主要依賴(lài)固有免疫系統(tǒng)抵御病原入侵，而其中由細(xì)胞免疫發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，細(xì)胞免疫所需要的血淋巴細(xì)胞主要通過(guò)造血作用快速補(bǔ)充。中華絨螯蟹是一種主要養(yǎng)殖于亞洲南部的重要經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物，成體內(nèi)存在獨(dú)立的造血組織。本研究以中華絨螯蟹為研究對(duì)象，鑒定了其成體造血組織的特征，利用流式細(xì)胞儀分選了不同血淋巴細(xì)胞亞群，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，探究了造血過(guò)程，闡述了活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）和甲殼動(dòng)物細(xì)胞因子EsAstakine對(duì)造血過(guò)程的調(diào)控機(jī)制。中華絨螯蟹的造血
4、組織位于其胃的背側(cè)，為一層一系列的卵圓形囊泡構(gòu)成的薄膜。其中的囊泡內(nèi)含有大量細(xì)胞核相對(duì)較大的圓形細(xì)胞。這些細(xì)胞由結(jié)締組織包裹，含有大量線(xiàn)粒體，并且多數(shù)造血組織細(xì)胞處于有絲分裂前期和中期。EdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)也證明了造血組織細(xì)胞呈現(xiàn)出相當(dāng)旺盛的DNA復(fù)制活動(dòng)。造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx1特異性表達(dá)在中華絨螯蟹造血組織中，可能存在3個(gè)不同的蛋白異構(gòu)體。GATA1在造血組織和血淋巴細(xì)胞中均有表達(dá)，但可能以不同的蛋白異構(gòu)體形式存在，參與新生血淋巴細(xì)胞的成熟與釋放。通過(guò)流式細(xì)胞儀分選，中華絨螯蟹的血淋巴細(xì)胞被分為P1和P2。P1型血淋巴細(xì)胞形狀較小，內(nèi)含大量著色較深的嗜
5、酸性顆粒，因此可能主要為粒細(xì)胞。P2型血淋巴細(xì)胞大小不一且顆粒度較小，可能主要由透明細(xì)胞和半粒細(xì)胞組成。正常條件下，P1和P2型血淋巴細(xì)胞都具有吞噬能力，并且吞噬率相似。但是LPS刺激之后，P1型血淋巴細(xì)胞的吞噬率顯著性上升，而P2型血淋巴細(xì)胞未出現(xiàn)顯著性變化，表明P1型血淋巴細(xì)胞是中華絨螯蟹中行使吞噬功能的主要細(xì)胞類(lèi)群。此外，P1型血淋巴細(xì)胞中的ROS、溶酶體及鈣離子水平也顯著高于P2型血淋巴細(xì)胞。RT-PCR結(jié)果表明，病原識(shí)別、吞噬、殺菌、溶酶體以及抗氧化作用相關(guān)I的基因在P1血淋巴細(xì)胞中特異性高表達(dá)；而酚氧化物酶原激活系統(tǒng)相關(guān)的基因在P2血淋巴細(xì)
6、胞中顯著性高表達(dá)。P1血淋巴細(xì)胞為免疫應(yīng)答中行使吞噬功能的主要細(xì)胞類(lèi)群，但仍有超過(guò)80%的P1血淋巴細(xì)胞不具有吞噬能力，同時(shí)造血組織細(xì)胞也具有一定的吞噬能力，結(jié)果也揭示了中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞并沒(méi)有完全特化，可能由多種細(xì)胞共同發(fā)揮類(lèi)似作用。本研究也構(gòu)建了造血組織和血淋巴細(xì)胞的六個(gè)轉(zhuǎn)錄文庫(kù)，共得到51,229,690條單邊變長(zhǎng)的序列，拼接后共得到31,346個(gè)基因作為參考基因組。經(jīng)過(guò)組裝之后，共篩選出362個(gè)差異表達(dá)基因。造血組織中高表達(dá)的301個(gè)基因富集在與DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞分裂以及能量代謝相關(guān)功能群。其中與線(xiàn)粒體ROS產(chǎn)生相關(guān)的基因mit
7、ochondrialcomplexesI在造血組織中的表達(dá)水平是血淋巴細(xì)胞中的8.6倍。這些上調(diào)基因表明了造血組織中具有旺盛的細(xì)胞分裂活動(dòng)以及氧化還原反應(yīng)。在61個(gè)血淋巴細(xì)胞上調(diào)的基因中，參與酚氧化酶原（prophenoloxidase,proPO）激活的蛋白酶以及proPO大量富集，表明proPO可能作為成熟血淋巴細(xì)胞的標(biāo)記分子。和血淋巴細(xì)胞相比，造血組織中的ROS水平相對(duì)較高。當(dāng)造血組織中的ROS被其清除劑NAC清除之后，可以延遲由嗜水氣單胞菌刺激引起的血淋巴細(xì)胞增多。推測(cè)ROS可促進(jìn)造血組織中細(xì)胞的增殖和分化，是中華絨螯蟹造血的重要調(diào)節(jié)因子。As
8、takine是甲殼動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的參與造血的細(xì)胞因子。本研究從中華絨螯蟹的EST庫(kù)中鑒定并克隆得到
