進(jìn)口油菜籽莖基潰瘍病菌檢測鑒定方法

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1、進(jìn)口油菜籽莖基潰瘍病菌檢測鑒定方法一、檢測流程樣品過篩陽性陰性PCR檢測病菌分離PCR檢測R檢測挑選種子陰性陽性陰性陽性致病性測試陽性陽性檢出L.maculans未檢出L.maculans二、取樣和過篩送檢樣品混勻，取1kg用作試驗樣品，用孔徑2.5mm和1.5mm的網(wǎng)篩過篩試驗樣品，篩上物多為豆莢等植株殘體，篩下物多為油菜籽碎片或小形種子。取篩上物、篩下物和種子各1-2g用于PCR初篩。三、PCR初篩建議使用如下方法，也可以使用其他成熟的PCR方法進(jìn)行檢測。取篩上物、篩下物和種子各1-2g，液氮研磨后各取樣0.1-0.2g，分別提取DNA，用油菜油菜莖基潰瘍病菌L.maculan

2、s特異性引物L(fēng)macF(5’-cttgcccaccaattggatccccta-3’)和LmacR(5’-gcaaaatgtgctgcgctccagg-3’)(Liuetal.2006)進(jìn)行PCR檢測，預(yù)期擴增產(chǎn)物為331bp?？蛇x用常用的植物DNA提取試劑盒或真菌DNA提取試劑盒。兩種樣品DNA各取1μL分別進(jìn)行PCR檢測，重復(fù)3次。PCR反應(yīng)總體積為30μL，包含：10mmol﹒L-1Tris-HCl；50mmol﹒L-1KCl（pH8.3）；1.5mmol﹒L-1MgCl2；dATP、dGTP、dCTP、dTTP濃度均為100μmol﹒L-1；引物濃度各為100nmol﹒L-

3、1；模板DNA為1μL；1.0UTaqDNA聚合酶（大連寶生物工程有限公司）。反應(yīng)循環(huán)程序為：94℃3min；94℃30s，63℃30s，72℃30s，35個循環(huán)；最后72℃5min。擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠1×TAE緩沖液中電泳，EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析。四、種子挑選若PCR檢測結(jié)果為陽性，挑選油菜籽或病殘體進(jìn)行分離試驗。在解剖鏡下挑選籽粒皺縮、干癟、變色、殘缺或有霉變的籽?；虿報w，每份種子樣品挑選不低于500粒。五、培養(yǎng)基制備制備普通PDA培養(yǎng)基，加入鏈霉素或（和）青霉素，使抗生素濃度為每毫升50－100個單位，倒皿備用。六、分離培養(yǎng)將種子置于滅菌蒸餾水中室溫浸泡處理

4、1天，轉(zhuǎn)入-20℃下冷凍處理1天，1％次氯酸鈉消毒5分鐘，無菌水3次洗滌后置于PDA培養(yǎng)基上，25粒/皿，在20~25℃12h黑暗/12h光照（12小時光暗交替）條件下培養(yǎng)10天，從第5天開始觀察種子周圍是否有菌絲產(chǎn)生。七、形態(tài)觀察逐粒檢查籽粒的培養(yǎng)情況，對菌落邊緣不整齊、有較多分枝白色菌絲、菌落上有結(jié)節(jié)狀顆粒點的，置于解剖鏡下觀察，挑取見到的菌絲結(jié)制片觀察。顯微鏡下分生孢子（Phomalingam）無色透明，橢圓形至紡錘形，兩端常見各1個油球，孢子大小3.3～6×1.4～2.3(μm)。有上述形態(tài)特征的分離物，轉(zhuǎn)入新的PDA培養(yǎng)基純化培養(yǎng)。八、PCR檢測取疑似分離物提取DNA，用

5、特異性引物如LmacF/LmacR進(jìn)行PCR檢測。九、致病性測試原則上應(yīng)根據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行致病性測定。選取健康的寧優(yōu)7號等感病油菜籽種植，在長出2片子葉后做致病性測試。將形態(tài)特征與油菜莖基潰瘍病菌L.maculans形態(tài)特征相符且PCR檢測陽性的分離物，用無菌水配制每毫升107個分生孢子液，針刺接種，黑暗保濕一天，置于15~20℃下生長觀察（可剪掉生出的心葉）。接種5-8天后接種點附近出現(xiàn)圓形淺褐色枯死斑，稍凹陷，對發(fā)病子葉再做病原菌分離，如形態(tài)特征仍為L.maculans，即完成整個檢測程序。十、結(jié)果判定分離物形態(tài)特征與L.maculans相符，PCR檢測為陽性，可視為L.mac

6、ulans。慎重起見，可參考致病性測試結(jié)果。十一、菌株保存陽性分離物可轉(zhuǎn)入PDA于4℃冰箱保存，或?qū)⒕z塊轉(zhuǎn)入30%滅菌甘油中于-70℃保存。