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《his蛋白純化操作步驟全》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、His蛋白的純化一目的蛋白樣液的收集1：-20度冰箱中取出pet30a-p26甘油菌2：菌種復(fù)蘇，將5ulP26菌種加入到5mlK+LB培養(yǎng)基中(1:1000加入卡納抗生素的LB培養(yǎng)基)，以未加菌的K+LB培養(yǎng)基作空白對(duì)照，37度搖床培養(yǎng)12-16h。3：擴(kuò)大培養(yǎng)，將5ml過(guò)夜培養(yǎng)的P26菌液按照1:100的比例接種到500mlK+LB培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng)至OD值為0.6（2h左右）4：誘導(dǎo)表達(dá)，擴(kuò)培后的菌種中加入1mg/mliptg，使iptg最終濃度1ug/ml(1mmol/l)37度搖床培養(yǎng)4h，置-70度保存或立即進(jìn)行下步操作5:收集包涵體，離心，50
2、00r15min,棄去上清液(可置于-20度保存)6:溶解包涵體，用PBS重懸細(xì)胞沉淀（約每毫升沉淀加5mlPBS）,放在冰上用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破菌（有效時(shí)間30-40min，超5s,停10s,及時(shí)換冰防止溫度過(guò)高使蛋白質(zhì)變性）7：蛋白提取液的收集，離心，5000r15min取上清（可4度保存），菌體保存，測(cè)菌體中目的蛋白含量大小使用8：介質(zhì)處理，取出底帽滴出多余液體，柱子頂部朝上直立固定好，蒸餾水洗滌一次，再用2倍樹(shù)脂體積的1*bindingbuffer平衡柱子，最后用1*bindingbuffer配置成50%的樹(shù)脂。9：介質(zhì)與核酸結(jié)合，從柱子上部加入蛋白
3、提取液，4度旋轉(zhuǎn)混勻1h，收集流出液(若需要流出液再重新過(guò)柱一次，以最大限度提高結(jié)合力)10：取10ml1*bindingbuffer洗樹(shù)脂，洗2次，流出液標(biāo)記洗滌順序保存11：樣品的收集，取10個(gè)1.5mlEP管分別標(biāo)記1,2,3……10，每次取1ml1*elutionbuffer加入樹(shù)脂內(nèi)滴入標(biāo)記1-10的EP管內(nèi)每管6滴（第8管的目的蛋白含量已經(jīng)很低,10管即可，若需要可適當(dāng)增加）12：樹(shù)脂的保存，若樣品體積大于柱子體積，樹(shù)脂10倍體積的PBS重新平衡后可馬上使用，若不使用可用蒸餾水洗滌樹(shù)脂，加入20%乙醇10ml-20度保存（一種蛋白樹(shù)脂可重復(fù)使用，
4、注意不要超過(guò)樹(shù)脂的結(jié)合能力）二檢測(cè)收集的樣品中目的蛋白量的大小13：取13個(gè)1.5mlEP管，分別標(biāo)記1#，2#，3#……10#，A,B,C從1號(hào)EP管內(nèi)取30ul樣液于1#號(hào)EP管內(nèi)，依次移取至10號(hào)于10#號(hào)，取30ul10步中第一次收集的流出液于標(biāo)記A的EP管中，取30ul第二次收集的流出液于標(biāo)記B的EP管中,將7步中保留的菌體用少量pbs稀釋并取30ul于標(biāo)記C的EP管內(nèi)。（此步驟結(jié)束后將收集的樣品放4度保存，防止蛋白快速降解）14：取5*的loadingbuffer7.5ul加入標(biāo)記1#-10#，A,B,CEP管中將其稀釋成1*loadingbuf
5、fer15：置100度電熱器加熱10min,取出后將其蒸發(fā)的水分離沉。（可-20度保存）16:電泳，安裝好后加1*的蛋白電泳液，拔出梳子，一孔加3.5ul蛋白marker,剩余孔加樣10ul，跑濃縮膠80，分離膠120。19：考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色20：考馬斯亮藍(lán)染色脫色液脫色（可4度保存）21：照相LB培養(yǎng)基的配置：nacl10g,蛋白胨（tryptone）10g,酵母提取物（yeastextract）5g配置成1L高壓蛋白膠的配置：1安裝好后用水試漏，倒出水后用吸水紙吸出剩余水分2按說(shuō)明配置相應(yīng)濃度分離膠3加分離膠每板7ml左右，分兩次加水補(bǔ)滿等
6、待其凝固4凝固后倒去上層水分殘留水分吸水紙吸取5按說(shuō)明配置相應(yīng)濃度濃縮膠6加入3ml左右濃縮膠7加入梳子等待其凝固8取下放于4度冰箱保存（多個(gè)中間用濕潤(rùn)吸水紙間隔）三樣品密度的測(cè)定BSA法測(cè)蛋白密度1：使用注意1）BSAStandardSolution使用前室溫放置，恢復(fù)至室溫或在20-50度水浴中復(fù)溫，輕彈混勻。2）BCAReagentA和BCAReagentB在低溫下可能會(huì)產(chǎn)生沉淀。使用前20-37度保溫，輕輕震蕩混合2：工作液的配置，BCAReagentA：BCAReagentB=100：1（例30ml工作液的配置，在30mlBCAReagentA中添
7、加0.3mlBCAReagentB）充分震蕩混勻?？?度存3天使用<200ul反應(yīng)體系>所需工作液總體積（ml）=（BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液8份或7份+檢測(cè)樣品數(shù)+1）*0.22mg/mlBSAStandard(ul)稀釋液(PBS)BSA終濃度(ug/ml)12002000903015006060100045757503090500151052501015012501200(Blank)根據(jù)上表BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液的稀釋方法制備BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線20min內(nèi)檢測(cè)完1:使用微孔板測(cè)定，BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液添加量25ul，待檢測(cè)樣品添加量25ul2:加入200ul工作液，混勻3:3
8、7度30min4:測(cè)630nm處的吸光值5：各濃度B
