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《誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院(272111)劉俊賓上海市黃浦區(qū)中心醫(yī)院(200002)藍(lán)首利湖北省武漢市華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院(46003田夏仁云摘要目的研究和評價轉(zhuǎn)化生長質(zhì)明膠(BMG)呈海綿狀,-20℃保存，使進(jìn)行細(xì)胞傳代，并計數(shù)細(xì)胞個數(shù)。第10因子一P}(TGF-P)和胰島素樣生長因子-用前紫外線照射12小時滅菌天細(xì)胞長滿了瓶壁，在進(jìn)行細(xì)胞傳代，即I(IGF-I)在BMG三維支架中對骨髓1.2骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分離用。25%胰蛋白酶清洗貼壁的細(xì)胞，將基質(zhì)千細(xì)胞(SMCS)向軟骨細(xì)胞分
2、化的影按Kadiyala等Pi描述的方法，取健康未貼壁的死細(xì)胞及分泌代謝產(chǎn)物清洗倒響。方法從大白兔的骼骨骨髓液中提取2月齡大白兔2-2.5千克(同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)出，再往瓶內(nèi)加入0.2595胰蛋白酶3-和分離骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，將無血清Mc5A驗(yàn)動物中心)，雌雄不限。氯胺酮十異丙嗅5.1，放人培養(yǎng)箱中2-3分鐘，觀察瓶內(nèi)培養(yǎng)液分為四組，含有5ng的TGF-P,肌注麻醉，雙側(cè)骼部剪毛后碘伏消毒，在貼壁的細(xì)胞已分離成為懸浮的圓形細(xì)和100ng的IGF一I組為A組、含有無菌條件下用16號骨穿刺針在骼骨翼胞，輕輕倒出胰酶，加入5.1上迷的四種
3、TGF-p.為B組含有IGF-1組為C組及外側(cè)穿人骨髓腔，注射器針管內(nèi)預(yù)先含不同的無血清Mc5A培養(yǎng)液。在無菌條無血清Mc5A培養(yǎng)液為D組作為空白對有0.1.[肝素鈉生理鹽水，抽吸骨髓液件下，將約7x7mm2大小的塊狀BMG支照，先進(jìn)行單層細(xì)胞培養(yǎng)的10天，再置6.1移人Mc5A培養(yǎng)液5m1的離心管內(nèi)架置人每個孔內(nèi)，使懸浮的細(xì)胞液覆蓋于松質(zhì)骨基質(zhì)明膠(BMG)支架中繼續(xù)培混勻，1500r/min離心5分鐘，棄上層于支架上，第20夭時觀察BMG支架中養(yǎng)10夭，然后進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色、蛋白脂肪和上清。加人適量無血清培養(yǎng)液懸細(xì)胞形態(tài)
4、及分布，收集BMG支架低溫儲多糖含量的測定。結(jié)果第5,10天后，各浮細(xì)胞，緩慢移人盛有比重為1.077淋巴存，以備檢側(cè)組單層細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞個數(shù)均有顯著性細(xì)胞分離液的離心管中(細(xì)胞培養(yǎng)液與2.檢測指標(biāo)差異，即A組>B組)C組>D組;第20天細(xì)胞離液之比1:1)，以2000r/min離心后各組的BMG支架蛋白多糖含量檢測20分鐘.小心吸取界面的有核細(xì)胞乳白2.1大體及倒置顯微鏡觀察結(jié)果，即A組>G組>B組>D組(P<層加人Mc5A培養(yǎng)液10.1,制成細(xì)胞懸第5,10夭時倒置顯微鏡下觀察細(xì)0.05)。結(jié)論旱期應(yīng)用TGF-p可提高骨
5、液移人25c.'培養(yǎng)瓶中，置于37`C,50k胞貼壁生長及增殖的情況，對各組增殖髓基質(zhì)千細(xì)胞的軟骨分化能力，而IGF-CO,及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行對比I可提高TGF-Pj對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞軟鏡下觀察呈形態(tài)一致的均質(zhì)分布均勻的2.2電鏡掃描骨分化作用細(xì)胞，可用于BMSC收集和移植。計數(shù)每隨機(jī)取出一個制備好的BMG支架瓶中含有【.5x10'個細(xì)胞/m{時，收集作電鏡掃描;在BMG支架中培養(yǎng)的細(xì)1.材料和方法的骨髓MSc低溫存儲中。胞，第20天后，進(jìn)行電鏡掃描觀察細(xì)胞1.1松質(zhì)骨基質(zhì)明膠(BMG)的制備13培
6、養(yǎng)和誘導(dǎo)MSc生長分布情況及增殖的密度。按沈靜如制備的方法加以改進(jìn)，在以每瓶中含有1.5x10'個細(xì)胞/ml開2.3硫酸氨聚多糖(glycosaminogly-無菌條件下，切取2月齡新西蘭大白兔始誘導(dǎo)培養(yǎng)，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，分為cansGAG)含最骼骨，去筋膜及皮質(zhì)骨，剩下的松質(zhì)骨，四組.每組10個孔，孔內(nèi)加人含有5ng/將各組BMG標(biāo)本解凍后，用濾紙吸用5mmol/LNaN,洗去血液，并浸泡24m1TGF-(3和100ng/mlIGF-I無血清干組織所帶的水，電子天平稱量組織濕小時用1:1氯仿甲醇反復(fù)脫脂直至液體Mc5
7、A培養(yǎng)液作為A組，加人含有5ng/重。二甲基亞甲基藍(lán)比色法測定標(biāo)本的清亮后，風(fēng)浴揮發(fā)。Lommol/1鹽酸進(jìn)行mlTGF-p無血清Mc5A培養(yǎng)液為B組GAG含量，每克濕重組織中GAC含量按脫鈣48小時，再次脫脂過夜.風(fēng)浴揮發(fā)。(5ng/ml為TGF-p，對MSG軟骨誘導(dǎo)的r列公式計算硫酸GAG含量(mg/g卜依次用2mol/LCaC1210.5mo1/LEDTA最佳劑量已得到證明)，加人含有l(wèi)00ng硫酸GAG量(mg)/組織濕重(引溶液浸泡,4mol/LLiCl連續(xù)抽提24小/mlIGF-I無血清Mc5A培養(yǎng)液作為C2.4
8、組織學(xué)觀察時，用三燕水反復(fù)0洗除去殘余試劑。以組，不加任何試劑的無血清Mc5A培養(yǎng)冷凍標(biāo)本解凍后，在4℃下用PBS浸無水乙醇，無水乙醚脫水、制成松質(zhì)骨基液作為D組作為空白對照組。第5天時泊1小時再酒精脫水，石蠟包埋，困成2007.11!36萬方數(shù)據(jù)611.切片，常規(guī)HE染色，甲苯胺蘭染B組
