cape在神經(jīng)膠質(zhì)瘤異常wntβcatenin通路中的作用及機(jī)制研究

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1、重慶醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文CAPE在神經(jīng)膠質(zhì)瘤異常Wnt/β-catenin通路中的作用及機(jī)制研究姓名：郭川申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：外科學(xué)（神經(jīng)外科）指導(dǎo)教師：唐文淵20090501重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文CAPE在神經(jīng)膠質(zhì)瘤異常Wnt／p．catenin通路中的作用及機(jī)制研究摘要咖啡酸苯乙酯(caffeicacidphenethylester，CAPE)是一種非細(xì)胞毒性抗腫瘤物質(zhì)，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有選擇性的抑制作用，而對(duì)正常細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒性作用。CAPE最早由蜂膠中提煉出來(lái)，是蜂膠抗腫瘤作用的主要活性成分，現(xiàn)在可以通過(guò)人工合成的方

2、法獲得。研究發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤作用可能在于抑制異常的Wnt／0．catenin信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制核因子．r,B(nuclearfactor-rd3，NF．KB)轉(zhuǎn)錄活性。Wnt／13．catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路是胚胎發(fā)育所必須的信號(hào)系統(tǒng)，過(guò)高或過(guò)低的表達(dá)都將改變細(xì)胞的生存狀態(tài)。目前已經(jīng)證實(shí)該系統(tǒng)的減低表達(dá)是引起阿爾茨海默病的重要原因，而過(guò)度激活則與多種人類(lèi)腫瘤的發(fā)生有密切的聯(lián)系。Wnt／13．catenin信號(hào)途徑可概括為：Wnt_Frz_Dsh_p．catenin的降解復(fù)合體解散_p—caten

3、in積累，進(jìn)入細(xì)胞核_TCF／LEF_基因轉(zhuǎn)錄(如c-myc、cyclinD1、VEGF)。13-catenin與Tcf結(jié)合成復(fù)合物并發(fā)生核轉(zhuǎn)位是此通路被過(guò)度激活的使動(dòng)因素，下游癌基因的激活則是腫瘤發(fā)生發(fā)展的直接推動(dòng)者。目前，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中已有關(guān)于干擾13-catenin表達(dá)的報(bào)道，但有關(guān)CAPE與神經(jīng)膠質(zhì)瘤中13-catenin表達(dá)的相關(guān)性目前還未見(jiàn)報(bào)道。我3重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文們考慮CAPE在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中是作用于此信號(hào)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也就是13-catenin的過(guò)表達(dá)與核轉(zhuǎn)位。因?yàn)镃APE如果只是抑制了某個(gè)下游靶基因，

4、則對(duì)上游基因影響很小。因此抑制上游關(guān)鍵基因，才會(huì)對(duì)抑制腫瘤起到明顯的作用。本研究的主要目的足：①研究CAPE對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的抑制作用②檢測(cè)CAPE體內(nèi)、外對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤異常Wnt／13．catenin通路13-catenin、Tcf-4及靶基因c．myc、VEGF的影響，探討CAPE作用于該通路的靶點(diǎn)。我們以13-catenin為切入點(diǎn)，采用免疫熒光、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、流式細(xì)胞、Westemblot等技術(shù)，觀測(cè)CAPE在體內(nèi)和體外對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤異常wnt／13-catenin通路13-catenin、Tcf-4及靶基因c．myc、

5、VEGF的影響，探討CAPE作用于該通路的靶點(diǎn)，并構(gòu)建重組腺病毒13-catenin及siRNA載體，探討13-catenin在CAPE抑制腫瘤中的作用，從而研究CAPE對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤抑制作用的分子機(jī)制，以期為CAPE的研究提供理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)的第一部分成功構(gòu)建Ad．13．catenin與Ad．p—cateninsiRNA腺病毒載體，使我們可以加強(qiáng)或抑制13-catenin在神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株及裸鼠移植瘤的表達(dá)。通過(guò)后面實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞株及移植瘤13-cateninmRNA和蛋白的檢測(cè)，兩種病毒轉(zhuǎn)染率高，表達(dá)穩(wěn)定，可以很好地用于膠質(zhì)瘤

6、異常Wnt／B．catenin通路的研究。本實(shí)驗(yàn)的第二部分通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)、激光共聚焦顯微鏡、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real．TimeQuantitativePCR)、Westernblot等技術(shù)，我們4重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文觀察到U251細(xì)胞株體外培養(yǎng)時(shí)給予CAPE干預(yù)后促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡，其基礎(chǔ)表達(dá)、過(guò)表達(dá)、低表達(dá)的13-catenin均被進(jìn)一步抑制，其下游的Tcf-4及靶基因c．myc、VEGFmRNA及蛋白均相應(yīng)降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：CAPE體外是通過(guò)抑制了U251細(xì)胞的13-catenin基因的表達(dá)與核轉(zhuǎn)位，游靶基因的表

7、達(dá)也相應(yīng)下降，因此對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起到一定的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)的第三部分通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Westernblot等技術(shù)，我們觀察到U251細(xì)胞荷瘤鼠在給予CAPE干預(yù)后，其基礎(chǔ)表達(dá)、過(guò)表達(dá)、低表達(dá)的13-catenin均被進(jìn)一步抑制，CAPE對(duì)移植瘤的抑瘤率達(dá)到48。39％(>40％為有效)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：CAPE體內(nèi)同樣是抑制了移植瘤的異常Wnt／13．catenin通路，對(duì)膠質(zhì)瘤的抑制效果明顯。綜上所述，CAPE是通過(guò)抑制了神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的異常Wnt／13一catenin通路中的13-catenin基因表達(dá)而對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤

8、起到一定的抑制作用。關(guān)鍵詞：咖啡酸苯乙酯，13-catenin，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，裸鼠，成瘤性重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文EFFECTSoFCAFFEICACIDPHENETHYLESTERINWNT／B．CATENINSIGNALING