植物基因工程及應用

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1、本課程內(nèi)容第一章緒論第二章基因克隆的工具酶第三章基因工程的載體第四章目的基因的制備第五章目的基因?qū)牒椭亟M子的篩選第六章外源基因的表達第七章基因操作的基本技術第八章植物基因工程及應用第九章動物基因工程及應用第十章醫(yī)學基因工程及應用10/5/20211歡迎同學們聽課！第八章植物基因工程及應用第一節(jié)高等植物的遺傳學特性第二節(jié)高等植物基因轉(zhuǎn)化第三節(jié)植物基因工程應用第四節(jié)轉(zhuǎn)基因的安全性10/5/20212歡迎同學們聽課！第一節(jié)高等植物的遺傳學特性a.遺傳操作的簡易性大多數(shù)高等植物可以開花授粉，通?？僧a(chǎn)生

2、大量的后代，所以即使是非常稀有的基因突變和基因重組事件，其遺傳后果也易被觀察。b.整株植物的再生性植物細胞具有全能性，單個細胞可以在適當激素濃度誘導下完成脫分化、再分化的過程，分化成為葉和根，莖，最終形成整株植株。所以轉(zhuǎn)化了外源基因的植物細胞可以再生形成完整的植株。c.染色體的多倍體性許多高等植物以多倍體的形式存在，大約三分之二的禾本科植物是多倍體，其染色體數(shù)目范圍從24至144不等！其特征是體細胞變異頻率高，在組織培養(yǎng)中植物細胞是遺傳不穩(wěn)定的。10/5/20213歡迎同學們聽課！第二節(jié)高等植物

3、基因轉(zhuǎn)化一.植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法植物遺傳轉(zhuǎn)化技術可分為兩大類：一類是直接基因轉(zhuǎn)移技術，包括基因槍法、原生質(zhì)體法、脂質(zhì)體法、花粉管通道法、電激轉(zhuǎn)化法、PEG介導轉(zhuǎn)化方法等，其中基因槍轉(zhuǎn)化法是代表。另一類是生物介導的轉(zhuǎn)化方法，主要有農(nóng)桿菌介導和病毒介導兩種轉(zhuǎn)化方法，其中農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化方法操作簡便、成本低、轉(zhuǎn)化率高，廣泛應用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。10/5/20214歡迎同學們聽課！二.農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)化方法(一)農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒與T-DNA的整合機制幾乎所有雙子葉植物都容易受到土壤農(nóng)桿菌感染，而產(chǎn)

4、生根瘤。它是一種革蘭氏陰性土壤桿菌（A.tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）質(zhì)粒介導的。農(nóng)桿根瘤菌之所以會感染植物根部是因為植物根部損傷部位分泌出酚類物質(zhì)乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮，這些酚類物質(zhì)可以誘導Vir（Virulenceregion)基因的啟動表達，Vir基因的產(chǎn)物將Ti質(zhì)粒上的一段T－DNA單鏈切下，而位于根瘤染色體上的操縱子基因產(chǎn)物則與單鏈T－DNA結(jié)合，形成復合物，轉(zhuǎn)化植物根部細胞。T－DNA上有三套基因，其中兩套基因分別控制合成植物生長素與

5、分裂素，促使植物創(chuàng)傷組織10/5/20215歡迎同學們聽課！10/5/20216歡迎同學們聽課！Ti質(zhì)粒的結(jié)構10/5/20217歡迎同學們聽課！表達載體pBIn19的結(jié)構10/5/20218歡迎同學們聽課！T-DNA上共有三套基因和左右兩個邊界，LB和RB是長為25bp的末端反復重復順序，在切除及整合過程具有重要意義。　tms由兩個基因組成：tms1（iaaM）和tms2（iaaH）　tmr由一個基因組成iptz：　tmt由若干基因構成，合成稀有氨基酸衍生物，稱為opines。它有三個成

6、員：　octopine＝精氨酸與丙酮酸的縮合物　Napaline＝精氨酸與－酮戊二酸的縮合物　Agropine＝谷氨酸與二環(huán)糖的縮合物　據(jù)此可將Ti質(zhì)粒分為三大類，感染的植物誘導合成這些有機堿，但不能利用它們，其分解酶基因在Ti質(zhì)粒上，分解產(chǎn)物為氨基酸和糖類，供根癌農(nóng)桿菌使用作為氮源及碳源。10/5/20219歡迎同學們聽課！2.T-DNA的整合機制：　　T-DNA的詳細整合機制尚不清楚，但有幾個環(huán)節(jié)是明確的：　　T-DNA切除由Vir區(qū)編碼的特異性內(nèi)切酶完成，分別在LB和RB的第三

7、個堿基和第四個堿基之間產(chǎn)生缺口，并形成單鏈T-DNA。　　T-DNA的LB和RB在整合中的作用是不對稱的，RB順序與整合有關，而LB無關。T-DNA的整合可以是單拷貝的，也可以是多拷貝的，成串聯(lián)形式排列，但整合位點的特異性尚未確定。10/5/202110歡迎同學們聽課！T-DNA的整合機制10/5/202111歡迎同學們聽課！(二).Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細胞的戰(zhàn)略１.Ti質(zhì)粒的改造有以下理由使天然的Ti質(zhì)粒不能作為表達載體使用：　　a.生長在培養(yǎng)基上的植物轉(zhuǎn)化細胞產(chǎn)生大量的生長素和分裂素阻止了

8、細胞再生長為整株植物，因此，必須除去生長素和分裂素基因。　　b.有機堿的合成與T-DNA的轉(zhuǎn)化無關，而且可能會影響植物細胞生長，因為有機堿合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，因此必須去除有機堿合成基因（tmt）　　c.Ti質(zhì)粒約為200kb，重組操作非常困難，也很難找到單一的酶切位點。10/5/202112歡迎同學們聽課！d.Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復制，為了使重組質(zhì)粒DNA的大量擴增，須添加入大腸桿菌復制子。加入植物細胞的篩選標記，如neor基因，使用植物細胞啟動子及末端polyA化信號，加入多聚