植物 tag 合成途徑相關(guān)基因的克隆與分析

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1、植物TAG合成途徑相關(guān)基因的克隆與分析植物種子中的油脂主要以三酰甘油（TAG）的形式儲存，TAG形式的產(chǎn)品在食品、保健品和工業(yè)產(chǎn)品方面都具有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值（王鏡巖，2000）。為了對含油量相關(guān)基因的功能進(jìn)行深入分析，本研究克隆或合成了催化整個(gè)三酰甘油合成途徑的含油量相關(guān)基因。利用同源序列法從油菜中克隆含油量相關(guān)基因DGAT的全長cDNA序列，對它們的序列特征進(jìn)行了生物信息學(xué)分析.2.1材料與方法2.1.1材料2.1.1.1供試植物材料甘藍(lán)型油菜（BrassicanapusL）中雙9號（ZS9）基因組D

2、NA用于本研究目的基因的分離，種子由本實(shí)驗(yàn)室保存。2.1.1.2菌株與質(zhì)粒大腸桿菌（Escherichiacoli.）克隆菌株Top10，購自Invitrogen公司；克隆目標(biāo)基因載體pAmp由本實(shí)驗(yàn)室吳剛博士構(gòu)建，商業(yè)化植物轉(zhuǎn)化載體pBI121（Kanr）購自ToYoBo公司。2.1.1.3酶與生化試劑ReverTraAce-α-TM試劑盒、高保真DNA聚合酶（KodPlus）購自ToYoBo公司；1kbDNALadderMarker、TaqDNA聚合酶購自Fermentas公司；Trizol購自I

3、nvitrogen公司;T4DNA連接酶購自NEB生物公司；限制性內(nèi)切酶其它工具酶皆購自寶生物工程（大連）有限公司和NEB公司；PCR純化試劑盒購自百泰克生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒購自北京索來寶科技有限公司；LB培養(yǎng)基成分，Car、Kan、Rif、Str等抗生素購自國內(nèi)相關(guān)廠商；PCR引物合成由上海生工生物技術(shù)公司完成。測序由華大基因研究院武漢測序中心進(jìn)行。2.1.1.4儀器與設(shè)備上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司恒溫培養(yǎng)箱；GRANT－000751制冰機(jī)；eppendorfcentrifuge－54

4、15、5424離心機(jī)；上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司三孔恒溫水浴鍋；中國科學(xué)院武漢科技儀器廠HQ452恒溫?fù)u床；FisherscienticficIsotemp3016連接儀；Millipore純水儀；eppendorfcentrifuge－5417冷凍離心機(jī)；BIO-RAD雙模塊PCR儀；美的微波爐一臺；BIO-RAD電泳儀；BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)；eppendorf各種規(guī)格移液槍一套。2.1.2方法2.1.2.1油菜葉片組織RNA的提取與RNA的反轉(zhuǎn)錄a)稱取100mg油菜葉片置于研缽中，加液氮迅速

5、用力將葉片碾成粉末，收集粉末至液氮預(yù)凍的2.0mlEP管；b)向管中加入1ml的Trizol和50μl的β-巰基乙醇，蓋緊EP管后迅速用力搖晃，直到粉末充分混入試劑；c)加200μl氯仿，同樣用力混勻，室溫靜置數(shù)分鐘；d)12000rpm，4℃離心15min；e)取上清,加等體積的氯仿，混勻；f)12000rpm，4℃離心5min；g)取上清,加等體積的異丙醇，混勻，于室溫靜置數(shù)分鐘；h)12000rpm，4℃離心15min，RNA即以膠狀沉淀形式附著于管底；i)加1ml70%的乙醇洗滌沉淀；j)12

6、000rpm離心5min，棄上清。移液槍吸走剩余液體，置超凈臺上數(shù)分鐘使乙醇揮發(fā)；k)加50μlDEPC水并吹打沉淀使其溶解。檢測，瓊脂凝膠電泳第一鏈cDNA的合成采用ReverTraAce-α-TM試劑盒完成，使用Oligo(dT)20和隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，體系如下：1×ReverTrabuffer2μldNTP1μlOligo(dT)201μlRandomprimer1URNaseinhibitor1UReverTraAce2μl總RNADEPC處理過的水補(bǔ)充體積至20μl反應(yīng)程序?yàn)?0℃5m

7、in，42℃30min，99℃5min。反應(yīng)所得cDNA稀釋20倍后分裝，即可用于PCR擴(kuò)增。2.1.2.2克隆基因所使用的引物PCR擴(kuò)增克隆基因引物根據(jù)GenBank中的相應(yīng)基因的mRNA序列從非編碼區(qū)與編碼區(qū)相連處分別設(shè)計(jì)表引物：2.1.2.3克隆基因的PCR反應(yīng)體系及條件目的基因擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系包括1μL模板cDNA，5μL10×buffer，4.5μL25mmol/LMgSO4，4.5μL2mmol/LdNTP，0.5μL10μmol/L正向引物，0.5μL10μmol/LP2反向引物，1.

8、0μL1U/μL高保真KodPlusDNA聚合酶，補(bǔ)ddH2O至50μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min，然后94℃30s，58℃30s，68℃1.5min，25個(gè)循環(huán)，最后68℃延伸5min，4℃保存。采用Bio-Rad雙頭PCR儀完成反應(yīng)，產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。2.1.2.4目的基因的克隆pAmp質(zhì)粒用EcoRV單酶切，酶切體系為1μL模板，5μL10×Buffe（r4），1μLBSA，1μLEcoRV，補(bǔ)ddH2O至50μL，37