lipofectamine 2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟 注意事項(xiàng)

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1、Invitrogen陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟注意事項(xiàng)2010-07-1016:16Invitrogen的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑：Lipofectamine2000Lipofectamine2000是最為人熟知的轉(zhuǎn)染產(chǎn)品之一。已知可為517種細(xì)胞（見下面連接地址）提供高轉(zhuǎn)染效率（表達(dá)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)）和活性（細(xì)胞抽提物中轉(zhuǎn)入基因的酶產(chǎn)物活性）。特點(diǎn)兩個(gè)關(guān)鍵性特點(diǎn)使得Lipofectamine2000試劑的轉(zhuǎn)染步驟快速簡(jiǎn)便：（1）DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑的復(fù)合體可以直接加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，有血清也不怕（2）轉(zhuǎn)染后不

2、需要除去Lipofectamine2000試劑，無(wú)需換培養(yǎng)基操作流程事實(shí)上Lipofectamine系列產(chǎn)品操作流程都是又快又簡(jiǎn)單：稀釋DNA以及Lipofectamine2000，混合2種稀釋液保溫20分鐘，加入培養(yǎng)細(xì)胞中孵育24－96小時(shí)檢測(cè)結(jié)果。下面是Invitrogen提供的詳細(xì)流程和注意事項(xiàng)。轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞鋪板，使其在轉(zhuǎn)染日密度為90%。細(xì)胞鋪板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。對(duì)于每孔細(xì)胞，使用50μl無(wú)血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基）稀釋0.8μg-1.0μgDNA。對(duì)于每孔細(xì)胞，

3、使用50μlOPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基稀釋1μl-3μlLIPOFECTAMINE2000試劑。Lipofectamine2000稀釋后保溫5分鐘（在30分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合。保溫時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)降低活性。）注意：即使Lipofectamine2000使用OPTI-MEMⅠ稀釋，細(xì)胞也可以使用D-MEM培養(yǎng)。如果D-MEM做為L(zhǎng)ipofectamine2000的稀釋液，必須在5分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合?；旌舷♂尩腄NA（第2步）和稀釋的Lipofectamine2000（第3步）。在室溫保溫20分鐘。注意：溶液可能會(huì)混濁，但不會(huì)影響轉(zhuǎn)染。復(fù)合物可

4、以在室溫保持6小時(shí)穩(wěn)定。直接將復(fù)合物加入到每孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。注意：如果在無(wú)血清條件下轉(zhuǎn)染，使用含血清的正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞鋪板。在加入復(fù)合物前移去生長(zhǎng)培養(yǎng)基，替換為0.5ml無(wú)血清培養(yǎng)基。在37℃，5％的CO2中保溫24-48小時(shí)，無(wú)須去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基或者在4-5小時(shí)后更換生長(zhǎng)培養(yǎng)基也不會(huì)降低轉(zhuǎn)染活性。在細(xì)胞中加入復(fù)合物24-72小時(shí)后，分析細(xì)胞抽提物或進(jìn)行原位細(xì)胞染色，檢測(cè)報(bào)告基因活性。這依賴于細(xì)胞類型和啟動(dòng)子活性。對(duì)穩(wěn)定表達(dá)，在開始轉(zhuǎn)染一天后將細(xì)胞傳代至新鮮培養(yǎng)基中，兩天后加入篩選抗生素。進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)需要數(shù)天或數(shù)周。對(duì)

5、于96孔板培養(yǎng)，不再需要提前一天進(jìn)行細(xì)胞鋪板，而可以直接在平板中制備復(fù)合物，然后將細(xì)胞懸浮液加入到復(fù)合物就可以了，這樣進(jìn)一步減少了轉(zhuǎn)染時(shí)間。這種改進(jìn)步驟已經(jīng)過293-H，293-F，COS-7L和CHO細(xì)胞的試驗(yàn)，同傳統(tǒng)方法相比活性稍低?？旖莸牟襟E和蛋白表達(dá)細(xì)胞系的高效轉(zhuǎn)染使得Lipofectamine2000非常適用于96孔板的高通量轉(zhuǎn)染，比如cDNA文庫(kù)的篩選和蛋白瞬時(shí)表達(dá)。適用細(xì)胞株范圍不同的轉(zhuǎn)染試劑所適用的細(xì)胞株范圍各不相同。一個(gè)實(shí)驗(yàn)室常常會(huì)用到不止一種細(xì)胞株，甚至是比較特殊的細(xì)胞株。一個(gè)轉(zhuǎn)染試劑所適用的細(xì)胞株越多，當(dāng)然越受用戶的歡迎

6、。根據(jù)Invotrogen網(wǎng)站的資料，Lipofectamine2000已經(jīng)證實(shí)可用于高達(dá)517種細(xì)胞株，覆蓋了相當(dāng)廣的范圍。要看看Lipofectamine2000是否適用于你現(xiàn)有的細(xì)胞株，可以訪問以下Invitrogen網(wǎng)址（http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageID=9559&fuseaction=CellLines.dsp_searchRange）適用的核酸類型和DNA大小有的轉(zhuǎn)染試劑是為siRNA轉(zhuǎn)染而設(shè)計(jì)的，有的則是為DNA轉(zhuǎn)染設(shè)計(jì)。Lipofectamine2000可以適用于包括DN

7、A，siRNA,dsRNA,熒光標(biāo)記的Oligo,RNA等在內(nèi)的核酸轉(zhuǎn)染，這使得Lipofectamine2000適用范圍非常廣泛，無(wú)論是基因表達(dá)分析的DNA轉(zhuǎn)染，或者是RNAi，Lipofectamine2000都能勝任，這樣你就不需要為不同目的購(gòu)買不同試劑了。值得注意的是，最常用的DNA轉(zhuǎn)染中有一個(gè)DNA大小的問題，太大的質(zhì)粒不那么好轉(zhuǎn)。我們暫時(shí)還沒有找到Lipofectamine2000相應(yīng)的資料。用量和價(jià)格好東西往往不便宜?？墒窃趯?shí)驗(yàn)室中，價(jià)格往往是最具有殺傷力的。Lipofectamine2000用的劑量大嗎？?jī)r(jià)格如何？根據(jù)說明書，

8、24孔板轉(zhuǎn)染每次用2ul左右，1.5mlLipofectamine2000大約可做750次24孔板轉(zhuǎn)染，或者大約150次6孔板轉(zhuǎn)染，而1.5mlLipofectam