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1、基因表達(dá)檢測第三部分：RT-PCR(ReversetranscriptionPCR)ReverseTranscriptionPCRRNA抽提cDNA反轉(zhuǎn)錄基因特異性引導(dǎo)Oligo(dT)引導(dǎo)隨機(jī)六核苷酸引物引導(dǎo)PCRNorthernBlotting基因表達(dá)分析NorthernBlottingAwardedNobelPrizeforChemistryin1993.基因表達(dá)水平（梁大成等，2006）表達(dá)增強(qiáng)克隆的RT-PCR和Northern雜交分析ladderc1357c1357c1357c1357c1357EI12I1EI22F22EI1K8EI35I
2、3?-actinABCDEA:IRBB10葉片接種白葉枯（PXO86）C:C101A51葉接種稻瘟?。╒86013）B:IRBB13葉片接種白葉枯（PXO99）D:MH63葉片接種稻瘟病（V86013）E:MH63葉片接種稻瘟?。?366）（周斌，2001，碩士論文）mRNA反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA可作為PCR的模板進(jìn)行擴(kuò)增稱為RT-PCR，RT-PCR比Northern雜交更靈敏，對RNA的質(zhì)量要求較低，操作簡便，它是在轉(zhuǎn)錄水平上檢測基因時空表達(dá)的常用方法。實驗原理被污染的試劑，緩沖液移液器使用的器皿及tip等操作者的手，頭發(fā)等RNA操作中應(yīng)注意的問題：
3、防止RNase污染外源RNase的主要來源：當(dāng)處理RNA時，移液器專用保證RNA實驗用的玻璃器皿、塑料制品和緩沖液等留出專用；溶液和試劑分裝成小份保存；RNA電泳裝置專用（清洗、處理、DEPC處理過的水沖洗）；防止外源RNase污染的主要措施(一）：準(zhǔn)備所有的溶液和緩沖液時，使用無RNA酶的玻璃器皿，DEPC處理過的水，用于RNA的化學(xué)藥品使用專用藥勺或直接敲擊瓶底分離，可能的話，用0.1％的DEPC在37oC處理溶液1小時后在15psi(1.05kg/cm2高壓蒸氣滅菌15min。180－300oC烘烤玻璃器皿4hrs以上或用其它滅活RNA酶的商品化
4、產(chǎn)品處理塑料制品；使用新的、無RNA酶的一次性tubes,tips等；在分離RNA的過程中用RNA酶抑制劑以抑制RNA酶的活性。防止外源RNase污染的主要措施(二）：材料要新鮮;裂解過程要同RNase活性抑制同步防止內(nèi)源RNA酶降解RNARNA酶抑制劑RNA酶是一種強(qiáng)有力的酶，在RNA分離和鑒定的各個階段嚴(yán)重威脅RNA的完整性。用來使RNA酶不發(fā)揮作用的RNA酶抑制劑主要有：DEPC(Diethyl-pyrocarbonate)或DMDC(Dimethyl-dicarbonate)氧釩核糖核苷復(fù)合物RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑DEPC:是高度活性的烷基化試
5、劑，通過組胺基團(tuán)乙氧基甲酸化形式破壞RNase的活性O(shè)CCOO-CH2-CH3-CH2-CH3氧釩核糖核苷復(fù)合物:能與多種RNA酶活性位點結(jié)合并幾乎百分之百地抑制RNA酶的活性RNA酶蛋白質(zhì)抑制劑RibonucleaseInhibitor可與RNase形成非共價的復(fù)合物，從而使RNA酶失活。不能在變性劑如SDS、胍等存在的情況下使用。RNAEXTRACTION(miniprep)RNA的制備與分析對于了解基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)和cDNA的合成都是必須的，RNA的純度和完整性對于Northernblot,RT-PCR和cDNA文庫的構(gòu)建等分子生物學(xué)實驗都
6、至關(guān)重要。RNA分離的方法很多，最關(guān)鍵的因素是盡量減少RNA酶的污染。實驗?zāi)康模簩W(xué)習(xí)RNA的簡易制備過程，通過RNA電泳帶評價RNA質(zhì)量實驗材料：水稻幼嫩葉片苯酚/氯仿反復(fù)抽提，價廉但質(zhì)不優(yōu)，尤其是對多酚等含量高的材料不適蛋白酶/SDS配合酚、氯仿抽提的方法強(qiáng)變性劑法。硫氰酸胍，鹽酸胍等，可配合氯化銫離心或有機(jī)溶劑提取。TrizolReagent提取方法：利用Trizol試劑抽提植物總RNATrizol試劑是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的單相的快速抽提總RNA的試劑，在勻漿和裂解過程中，能在破碎細(xì)胞、降解細(xì)胞其它成分的同時保持RNA的完整性。在氯仿抽提、離
7、心分離后，RNA處于水相中，將水相轉(zhuǎn)管后用異丙醇沉淀RNA。用這種方法得到的總RNA中蛋白質(zhì)和DNA污染很少，可以用來做Northern,RT-PCR,分離mRNA，體外翻譯和分子克隆等。75％乙醇（inDEPC-treatedwater)氯仿異丙醇（RNA專用）RNase-freewater：DrawwatertoRNase-freeglassbottles.Adddiethylpyrocarbonate（DEPC）to0.1%.Letstandovernightandautoclave.防止外源RNase的污染：應(yīng)戴口罩和手套，環(huán)境潔凈；玻璃器皿1
8、80oC烘烤3hrs以上；塑料制品DEPC水清洗，蛋白質(zhì)變性劑處理；一次性用品如tube,ti
