鄭州大學(xué)2008年博士學(xué)位論文

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1、鄭州大學(xué)2008年博士學(xué)位論文SV40T抗原基因在轉(zhuǎn)基因小鼠胃壁細(xì)胞特異性表達(dá)及生物學(xué)特性研究SV40T抗原基因在轉(zhuǎn)基因小鼠胃壁細(xì)胞特異性表達(dá)及生物學(xué)特性研究博士研究生陳輝導(dǎo)師張欽憲鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院鄭州450052摘要胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一,其死亡率居各種惡性腫瘤之首位。近年來,隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、病理學(xué)等高新技術(shù)的迅速發(fā)展,國內(nèi)外對(duì)胃癌的基礎(chǔ)和防治研究取得了長足進(jìn)步。但這些研究大部分是在臨床基礎(chǔ)上對(duì)胃癌患者的回顧性研究,在時(shí)間和空間上存在許多局限性。如要驗(yàn)證各種可疑的致癌、促癌因素,闡明胃癌發(fā)生的發(fā)病機(jī)制,探討抗癌藥物的作用機(jī)制并對(duì)其進(jìn)行

2、篩選,則必須建立胃癌動(dòng)物模型。人類疾病動(dòng)物模型在醫(yī)學(xué)發(fā)展中起著十分重要的作用。多年來一般采用誘變劑處理的方法來篩選建立腫瘤動(dòng)物模型,但此方法誘變發(fā)生的不確定性、腫瘤產(chǎn)生的隨機(jī)性、動(dòng)物無法在整體水平產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)等缺點(diǎn),使其應(yīng)用受到一定的限制。而轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型則克服了以上缺點(diǎn),能在動(dòng)物整體水平觀察所轉(zhuǎn)入基因的生物學(xué)效應(yīng),探討其在動(dòng)物體內(nèi)的組織特異性表達(dá)或調(diào)控過程,為癌基因作用機(jī)理、癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展過程、基因表達(dá)調(diào)控等方面研究提供寶貴資料,并為建立人類疾病動(dòng)物模型開創(chuàng)新的科研途徑。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(transgenicanimal)是用基因工程技術(shù)將外源基因通過生殖細(xì)胞或早期胚

3、胎導(dǎo)入動(dòng)物胚胎染色體基因組中,使之穩(wěn)定整合并傳遞給后一代的動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是生物學(xué)領(lǐng)域最新重大進(jìn)展之一,在醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、畜牧獸醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域有無限廣闊的前景。目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)大多采用受精卵細(xì)胞的顯微基因注射技術(shù)或電轉(zhuǎn)移技術(shù),其操作包括外源基因重組載體的構(gòu)建、受精卵細(xì)胞的采集、外源基因的顯微注射、注射后受精卵(或胚胎)的移植、轉(zhuǎn)基因小鼠的檢測(cè)等步驟。國外已建立了人遺傳病和癌基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型,用于腫瘤和遺傳學(xué)研究,但這方面的研究在我國尚屬起步階段。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型研究中廣泛采用的SV40(SimianVirus40,SV40)屬乳多鄭州大學(xué)2008年博_l

4、:學(xué)位論文SV40T抗原基因在轉(zhuǎn)基因小鼠胃壁細(xì)胞特異性表達(dá)及生物學(xué)特性研究空病毒科(papovaviridae)多瘤病毒屬(polyomavirus),在病毒DNA復(fù)制前編碼2種轉(zhuǎn)化蛋白,即大T抗原(largeTantigen,Tag)和小T抗原(smalltantigen,tag)oTag是一種磷酸化蛋白,在細(xì)胞轉(zhuǎn)化中起決定性作用,為細(xì)胞轉(zhuǎn)化所必需。tag是非磷酸化蛋白,對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化并非必需,但可起加強(qiáng)作用。SV40基因編碼的大T抗原己廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物腫瘤模型的建立。如Santarelli等將SV40T基因?qū)胄∈蠹?xì)胞構(gòu)建了小鼠乳腺癌動(dòng)物模型;Brister等將S

5、V40T基因和含金屬筑基基因的融合基因質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠生殖系產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因小鼠成年后可發(fā)生腦脈絡(luò)從乳頭狀瘤,Hochman建立了眼部腫瘤轉(zhuǎn)基因小鼠模型。胃壁細(xì)胞是胃底腺的主要細(xì)胞類型之一,能合成和分泌鹽酸,從而刺激胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞和胰液的分泌。H丫K'ATP酶(H丫K"ATPase)基因在胃壁細(xì)胞中特異性表達(dá),和胃酸的合成與分泌有著直接關(guān)系。Gordon建立了在胃壁細(xì)胞中特異性表達(dá)人生長激素(humangrowthhormone,hGH)、內(nèi)在因子(intrinsicfactor,INF)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型,為研究胃薪膜上皮細(xì)胞的發(fā)生、演化過程奠定了基礎(chǔ)。我們構(gòu)建胃壁細(xì)胞H丫

6、K'ATPase亞基啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的SV40T基因的真核表達(dá)載體,并將其導(dǎo)入小鼠受精卵細(xì)胞建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。該模型動(dòng)物將實(shí)現(xiàn)SV40T基因在胃壁細(xì)胞中的特異性表達(dá),并誘發(fā)小鼠胃壁細(xì)胞增生,胃薪膜發(fā)生癌前病變、癌變等一系列病理性改變,從而為胃癌發(fā)生機(jī)理的研究、胃癌的診斷與治療、胃癌特異性藥物的篩選提供十分有用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。方法一、SV40T基因胃壁細(xì)胞特異性表達(dá)載體的構(gòu)建1.擴(kuò)增H'/K'ATPase亞基啟動(dòng)子:采用酚一氯仿法從小鼠肝細(xì)胞中提取基因組DNA,PCR擴(kuò)增H'/K'ATPase亞基啟動(dòng)子,PCR產(chǎn)物命名為HK.2.pMT/HK的制備:將PCR產(chǎn)物純化回收后

7、與pMT18一載體相連,轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDN5Q細(xì)胞,從轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取8個(gè)單菌落,37℃搖菌過夜培養(yǎng),取菌液提取質(zhì)粒DNA,XbaI,BamHI雙酶切鑒定出陽性克隆,命名為pMT/HK并進(jìn)行測(cè)序鑒定。3.構(gòu)建pcDNA3.1/HK質(zhì)粒:將pMT/HK用XbaI,BamHI雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收約1060bp的DNA片段。將回收產(chǎn)物與用XbaI,BamHI雙酶切的pcDNA3.1(一)質(zhì)粒連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a細(xì)胞,從轉(zhuǎn)化平板上挑單菌落,鄭州大學(xué)2008年博士學(xué)位論文SV40T抗原基因在轉(zhuǎn)基因小鼠胃壁細(xì)胞特異性表達(dá)及生物學(xué)特性研究

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