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1、人胰高血糖素樣肽朱清顧云，陸偉，劉梅【摘要】目的：對人胰高血糖素樣肽-1（hGLP-1）進(jìn)行基因突變，構(gòu)建GST融合蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T/（Val8）hGLP-1，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)。方法：選擇大腸桿菌偏愛密碼子，將hGLP-1（7～37）第2位的丙氨酸（Ala8）定點突變?yōu)槔i氨酸（Val8），直接生物合成4個寡聚核苷酸片段并進(jìn)行基因拼接，形成完整的hGLP-1突變體基因（Val8）hGLP-1，并連接到載體pGEX-4T-1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，BamHI與XhoI雙酶切電泳鑒定與序列測定，然后誘導(dǎo)表達(dá)其融合蛋白。結(jié)果：經(jīng)酶切電泳鑒定
2、與測序分析，證實所合成的突變體基因（Val8）hGLP-1已克隆到pGEX-4T-1中，經(jīng)SDS-PAGE分析可以誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋白。結(jié)論：成功地構(gòu)建了GST融合蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T/（Val8）hGLP-1，為進(jìn)一步獲得重組hGLP-1蛋白奠定基礎(chǔ)，為產(chǎn)業(yè)化規(guī)模制備hGLP-1突變體提供實驗依據(jù)?！娟P(guān)鍵詞】人胰高血糖素樣肽-1；融合蛋白；基因突變；克??；糖尿病ConstructionofexpressionvectorofhumanGlucagon-likepeptide-1mutantgene[Abstract]Objective:Too
3、btainthemutantgeneofhumanGlucagon-likepeptide-1(hGLP-1),constructtheexpressionvectorofpGEX-4T/（Val8）hGLP-1,andexpresstheGSTfusionproteininE.colicells.Methods:arker、λDNA/HindⅢMarker均為TaKaRa公司產(chǎn)品,T4DNA連接酶和瓊脂糖為Promega公司產(chǎn)品，質(zhì)粒抽提試劑盒為TIANGEN公司產(chǎn)品，預(yù)染蛋白Marker為上海Biolabs公司產(chǎn)品。1.2方法1.2.1hGLP-1
4、突變體cDNA序列設(shè)計與合成參照文獻(xiàn)[6]并加以改進(jìn)，以纈氨酸（Val8）取代hGLP-1N端第二位丙氨酸(Ala8)，根據(jù)其氨基酸序列，選擇大腸桿菌偏愛的密碼子，設(shè)計并合成待重組的含第二位點突變(Val8)密碼子的（Val8）hGLP-1cDNA序列。設(shè)計合成4個寡聚核苷酸片段（F1～F4），由英駿生物技術(shù)有限公司合成，其長度分別為：F1：54nt；F2：54nt；F3：58nt；F4：50nt；合成基因總長度為112bp；包括位于5'端BamHI和3'端XhoI酶切位點；兩個終止密碼子TGA和TAA；在GST與（Val8）hGLP-1編碼序列之間加
5、入溴化氰裂解位點蛋氨酸密碼子ATG。hGLP-1突變體cDNA序列設(shè)計如下：F1：5'-GATCCATGCACGTAGAAGGTACCTTCACCT-CTGACGTATCCTCTTACCTGGAAG-3'F2:5'-GCCAGGCTGCTAAAGAATTCATCGCTTGG-CTGGTTAAAGGCCGTGGTTGATAAC-3'F3:5'-AGCCTGGCCTTCCAGGTAAGAGGATACGT-CAGAGGTGAAGGTACCTTCTACGTGCATG-3'F4:5'-TCGAGTTATCAACCACGGCCTTTAACCAGC-CAAGCGAT
6、GAATTCTTTAGC-3'1.2.2目的基因（Val8）hGLP-1的獲得（1）寡聚核苷酸的復(fù)性分別將合成的四個寡聚核苷酸鏈F1、F2、F3、F4用TE溶解。分別將等摩爾的F1與F3，F(xiàn)2與F4進(jìn)行兩兩復(fù)性，并使之終濃度為1pmol/μl，復(fù)性總體系均為20μl。復(fù)性條件均為90℃5min、65℃10min后靜置冷卻至室溫；（2）雙鏈片段的拼接：取復(fù)性好的F1F3、F2F4雙鏈按如下體系混合各溶液：F1F33μl,F2F43μl,2×DNA連接酶buffer10μl，T4DNA連接酶（3U/μl）2μl，ddH2O2μl，總體系20μl；37℃水浴
7、孵育3～4h。然后行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.2.3原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T/（Val8）hGLP-1的構(gòu)建用BamHI和XhoI對原核表達(dá)載體PGEX-4T-1進(jìn)行雙酶切，將目的基因與酶切好的PGEX-4T-1原核表達(dá)載體于14～16℃連接3～4h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，通過氨芐青霉素（Amp）選擇培養(yǎng)后，挑取獨立、分離的單克隆4～6個，分別置于內(nèi)含Amp的5ml液體LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過夜。取培養(yǎng)好的菌液離心后回收菌體，質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，用BamHI和XhoI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，將酶切片段長度符合
8、插入片段長度的重組質(zhì)粒送上海英駿公司測序部測序鑒定。(責(zé)任編輯：admin)1.2.4重組誘導(dǎo)
