培養(yǎng)細(xì)胞冷凍保存與復(fù)蘇

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1、培養(yǎng)細(xì)胞的冷凍保存與復(fù)蘇一、概述Spallanzani（1776）最早發(fā)表了冷“處理”對(duì)“細(xì)胞”生命活動(dòng)影響的報(bào)道，他用雪冷凍玻璃瓶中的馬精子10多分鐘之后，再將玻璃瓶放回室溫下，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)令人驚奇的現(xiàn)象，那些原本已經(jīng)不動(dòng)了的精子又“復(fù)活”了，就好象是剛從輸精管排出來(lái)的一樣，冷處理延長(zhǎng)至數(shù)十分鐘，情況依然如此。于是，他認(rèn)為冷不能殺死精子。大約100年以后，許多早期的學(xué)者重復(fù)了低溫處理對(duì)精子活動(dòng)的影響，同樣得出了相似的結(jié)論。到1900年前后，科學(xué)家基本上肯定了生物成分（如精子和一些生物化學(xué)物質(zhì)）能夠在零下溫度貯存的事實(shí)。Shettles（1940）證明人類的精子也能抵

2、抗溫度的突然變化，他將人的精液封閉在小管內(nèi)，在-79℃～-196℃之間的低溫條件下進(jìn)行冷處理，發(fā)現(xiàn)有10%的精子仍然能夠存活。此后，冷凍處理研究材料的范圍大大拓展。Polge等人（1949）發(fā)現(xiàn)了甘油對(duì)低溫下貯存的細(xì)胞具有保護(hù)作用，他們?nèi)匀灰跃舆M(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，加入甘油能夠大大提高貯存于-79℃下精子的存活率。接下來(lái)的重大進(jìn)展是Luyet（1951）與Lovelock（1953）等多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)了電解質(zhì)濃度對(duì)貯存細(xì)胞的損傷作用。他們的結(jié)論是，電解質(zhì)濃度增大是造成貯存細(xì)胞損傷的主要原因。冷凍理論后來(lái)得到Merryman（1956）、Rey（1957）以及Smith（196

3、1）等學(xué)者的繼續(xù)和發(fā)展。1949年至1960年這一段時(shí)間可以稱為冷凍保存的“甘油時(shí)期”，這一時(shí)期對(duì)生物材料的冷凍保存一般都是以甘油作為保護(hù)劑。Lovelock（1959）等人發(fā)現(xiàn)了一種新的化學(xué)保護(hù)劑，這就是人們熟悉的二甲基亞砜（DMSO）。而且，用于冷凍保存的儀器也有明顯的發(fā)展。目前，無(wú)論是冷凍保存理論、各種保護(hù)劑、冷凍用品和設(shè)備以及各種生物材料的保存與復(fù)蘇技術(shù)都已十分成熟和完備。二、冷凍保存與復(fù)蘇原理在低于-70℃的超低溫條件下，有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚至終止。因此，采取適當(dāng)?shù)姆椒▽⑸锊牧辖抵脸蜏?，即可使生命活?dòng)固定在某一階段而不衰老死亡。當(dāng)以適當(dāng)

4、的方法將凍存的生物材料恢復(fù)至常溫時(shí)，其內(nèi)部的生化反應(yīng)可恢復(fù)正常。所謂冷凍保存，就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于-70℃的超低溫條件），并在此溫度下對(duì)其長(zhǎng)期保存的過(guò)程。而復(fù)蘇就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復(fù)到常溫的過(guò)程。不論是微生物、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進(jìn)行凍存，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。水在低于零度的條件下會(huì)結(jié)冰。如果將細(xì)胞懸浮在純水中，隨著溫度的降低，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)結(jié)冰，所形成的冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞而引起細(xì)胞死亡。這種因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而

5、導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為細(xì)胞內(nèi)冰晶的損傷。如果將細(xì)胞懸浮在溶液中，隨著溫度的降低，細(xì)胞外部的水分會(huì)首先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高。如果將細(xì)胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞膜上脂質(zhì)分子會(huì)受到損壞，細(xì)胞便發(fā)生滲漏，在復(fù)溫時(shí)，大量水分會(huì)因此進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞死亡。這種因保存溶液中溶質(zhì)濃度升高而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為溶質(zhì)損傷或稱溶液損傷。當(dāng)溫度進(jìn)一步下降，細(xì)胞內(nèi)外都結(jié)冰，產(chǎn)生冰晶損傷。但是如果在溶液中加入冷凍保護(hù)劑，則可保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。因?yàn)槔鋬霰Ｗo(hù)劑容易同溶液中的水分子結(jié)合，從而降低冰點(diǎn)，減少冰晶的形成，并且通過(guò)其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電

6、解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷，細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。在復(fù)蘇時(shí)，一般以很快的速度升溫，1-2分鐘內(nèi)即恢復(fù)到常溫，細(xì)胞內(nèi)外不會(huì)重新形成較大的冰晶，也不會(huì)暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間，從而無(wú)冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生，凍存的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的冷凍保護(hù)效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復(fù)溫速率有關(guān)。而且不同的冷凍保護(hù)劑其冷凍保護(hù)效果也不一樣?！Ю鋬鏊俾世鋬鏊俾适侵附禍氐乃俣龋苯雨P(guān)系到冷凍效果。細(xì)胞在冷凍過(guò)程中會(huì)發(fā)生如下變化：當(dāng)細(xì)胞被冷至-5℃時(shí)，因溶液中加有冷凍保護(hù)劑而降低溶液的冰點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰；當(dāng)被冷至-5～-15℃

7、之間時(shí)，細(xì)胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細(xì)胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會(huì)比細(xì)胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的化學(xué)能。其結(jié)果是，細(xì)胞內(nèi)水分子為了和細(xì)胞外水分子保持化學(xué)能的平衡，會(huì)向細(xì)胞外流動(dòng)。冷凍速度不同，細(xì)胞內(nèi)水分向外流動(dòng)的情況也不相同：如果冷凍速度慢，細(xì)胞內(nèi)水分外滲多，細(xì)胞脫水，體積縮小，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細(xì)胞內(nèi)不會(huì)發(fā)生結(jié)冰；如果冷凍速度快，細(xì)胞內(nèi)水分沒(méi)有足夠的時(shí)間外滲，結(jié)果隨著溫度的下降而發(fā)生細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰；如果冷凍速度非?？欤闯焖倮鋬觯?，則細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀態(tài)（玻璃化冷凍）。Luyet（1973）證實(shí)液體的凝固可分為兩種形式