資源描述：
《鼠hmgb1蛋白的原核表達及分離純化 》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、鼠HMGB1蛋白的原核表達及分離純化趙中夫楊慧劉明社張蕓楊柳絮封江南【關鍵詞】高遷移率族蛋白1；原核表達載體；純化 摘要目的：克隆小鼠HMGB1基因，構建原核表達載體，在大腸桿菌中誘導表達并分離純化獲得His-HMGB1的融合蛋白。方法：脂多糖刺激后的RAGB1的目的片段，克隆于pMD-19T載體，再亞克隆至含有pelB引導肽及His-標簽肽的高效表達載體pET-26b(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導后行SDS-PAGE鑒定目標蛋白表達，用鎳鰲合瓊脂糖凝膠親和層析法分離純化含His-標簽肽的目的蛋白。結果：經(jīng)PCR擴增出大小為648bp的HM
2、GB1基因片段，成功構建目標蛋白的融合表達載體，經(jīng)誘導表達及分離純化，獲得了約30kD的融合蛋白。結論：構建HMGB1的融合表達載體，獲得分離純化融合蛋白His-HMGB1，為進一步研究其生物學功能奠定了基礎?！ ￡P鍵詞高遷移率族蛋白1；原核表達載體；純化 MouseHMGB1ProkaryoticExpressionandPurification AbstractObjective:ToclonemouseHighmobilitygroupbox1(HMGB1)geneandconstructtheprokaryoticexpressionvector,toi
3、nduceandpurifytheexpressedfusionproteinHMGB1.Methods:ThetotalRNAmouseRAD-19T.ThebinantvectorplateforPCRingE.coliBL21(DE3)andfourhoursinductionbyIPTG,HMGB1expressionconfirmedbySDS-PAGEandthepurificationedbyNi2+-chelateaffinitychromatograph.Results:ThetargetDNAsequenceofHMGB1idpET-26b(+)
4、-HMGB1obilitygroupbox1;Prokaryoticexpressionvector;Purification 高遷移率族蛋白B1(Highmobilitygroupbox1，HMGB1)是廣泛存在于真核細胞內(nèi)的高度保守的非組蛋白染色體蛋白，基本組全長648bp編碼215個氨基酸殘基〔１〕。已有研究表明，HMGB1可由巨噬細胞或單核細胞等主動分泌，或由壞死細胞被動釋放，從而作為一種炎癥晚期因子參與膿毒癥等病理過程〔２，３〕。研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)脂多糖（LPS）刺激巨噬細胞后HMGB1的分泌量較未刺激明顯增多，并且在8h～12h達峰值。而HMGB1發(fā)揮作用的
5、機制還不是很清楚。因此，分離純化HMGB1蛋白將對進一步研究HMGB1的生物學功能、與其他細胞因子的相互作用關系等有重要意義。本實驗以小鼠巨噬細胞RAGB1的目標序列，構建pMD-19T-HMGB1重組載體,亞克隆至高效表達載體pET-26b(+)，誘導表達并分離純化含His-標簽肽的HMGB1融合蛋白?！ ?材料和方法 1.1材料小鼠RAD-19T克隆載體購自大連寶生物工程有限公司；pET-26b(+)表達載體購自Novagen公司；TrizolRNA抽提試劑購自Invitrogen生物公司；PCR及膠中DNA回收純化試劑盒、小規(guī)模質(zhì)粒DNA提取純化試劑盒購自中
6、鼎生物技術有限公司；各種限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶及DNA標準Marker購自大連寶生物工程有限公司；T4DNA連接酶購自北京紐英倫生物技術公司；低分子量標準蛋白Marker購自MBIFermentas公司。引物由武漢伯杰生物技術公司合成；測序送上海英駿生物技術有限公司。 1.2方法 1.2.1PCR引物的設計：以小鼠HMGB1cDNAGeneBank（NM010439.2）查詢的有效序列為模板，首輪PCR引物為：上游f1：5＇-CGGGATCCCACTGGGCGACTCTGTGCCT-3＇（引入BamHⅠ酶切位點及兩個保護堿基），下游r1：5＇-CGGA
7、ATTCTGCGCTAGAACCAACTTATTCATC-3＇（引入EcoRⅠ酶切位點及兩個保護堿基）。HMGB1目標基因的擴增引物：上游hmgb1-f25＇-CGGGATCCGATGGGCAAAGGAGATCCTAAAA-3＇（引入BamHⅠ酶切位點及兩個保護堿基），下游hmgb1-r25＇-CCCTCGAGTTCATCATCATCATCTTCTTCTTCA-3＇（引入XhoⅠ酶切位點及兩個保護堿基)?！ ?.2.2總RNA的抽提及RT-PCR：選擇生長面積達瓶底70%的RAGB1的697bp片段，克隆至pMD-19T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)酶切鑒定及序
