紅細胞凝集試驗(ha)及紅細胞凝集抑制試驗

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1、紅細胞凝集試驗（HA）與紅細胞凝集抑制試驗（HI）2007-12-0711:42用疫苗按一定免疫程序進行免疫接種是控制雞病流行的主要途徑之一，這種觀點已被廣大養(yǎng)殖戶接受并引起足夠重視。但雞群免疫抗體的產(chǎn)生及維持時間受到雞群免疫應答能力、所用疫苗種類、免疫方法、免疫次數(shù)、疫病流行狀況等方面的影響，良好的免疫接種不等于雞群能夠產(chǎn)生良好的保護力。因而通過對雞群進行抗體監(jiān)測，及時檢查雞群的免疫狀態(tài)、疫苗使用效果，為制定合理的免疫程序提供依據(jù)就顯得非常重要。通過對廣大養(yǎng)殖戶的大量調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由于缺乏有效的監(jiān)測手段，養(yǎng)殖戶普遍存在盲目免疫的現(xiàn)象。因此，建立合理的抗體監(jiān)測制度，開展免疫抗體監(jiān)測工作，

2、已經(jīng)成為我們當前養(yǎng)雞生產(chǎn)中急需開展的一項重要工作。下面將抗體監(jiān)測所需設備及監(jiān)測過程向大家做一說明。一、實驗用設備：1、離心機1臺*（3000轉(zhuǎn)離心紅細胞）2、冰箱1臺*（存放抗原）3、振蕩器1臺*（振蕩96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、減蛋（EDS）、流感（AI）抗原，從正規(guī)廠家進。5、96孔V型板稀釋血清清洗后可重復使用6、八道移液器1把（5-50微升稀釋血清）7、吸頭和八道移液器配套使用，清洗后重復使用）8、積液槽配制4個單位抗原及盛放生理鹽水加樣用9、一次性采血管采血用10、2毫升注射器采血用11、紅細胞非免疫雞心臟采血或免疫雞也可，但需離心5次后使用。12、檸檬酸三鈉配制

3、3.8％抗凝劑用13、重鉻酸鉀配制清潔液用14、硫酸配制清潔液用15、吸管1毫升、10毫升16、吸耳球和吸管配套使用17、針頭9*13（采雛雞）、9*25（采大雞）18、蒸餾水當?shù)刭I。清洗96孔V型板、吸頭用19、10毫升離心管離心紅細胞用（塑料制）20、生理鹽水做血清稀釋液用、配制4單位抗原二、實驗前的準備：1.抗原：從指定廠家購買穩(wěn)定濃縮抗原。2.抗凝劑的配制：用天平稱量3.8克檸檬酸三鈉，溶入100ml生理鹽水中，待溶解完全后即可使用。3.1％紅細胞懸液：由雞心臟或翅靜脈采血，放入加有抗凝劑的離心管內(nèi)（按抗凝劑：全血＝1：2的比例），迅速混勻。在離心機中以3000轉(zhuǎn)/分離心5分

4、鐘，用吸管吸去上清液和紅細胞上層的白細胞薄膜，將沉淀的紅細胞加生理鹽水，慢慢混合均勻，再在離心機中3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄去上清液，再加生理鹽水混勻，如此反復離心4～5次，最后一次離心后的紅細胞，棄去上清液，即為紅細胞泥。放入4℃冰箱中可保存2—3天。使用時用1ml吸管吸取0.1ml紅細胞泥，然后加入9.9ml的生理鹽水，此即1%紅細胞懸液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。4.被檢血清：每只雞心臟或翼下采血0.5-1ml,靜置或離心，待血清析出后備用。5.吸管清潔液的配制：使用1%的稀硫酸溶液。水10公斤，硫酸100毫升，將硫酸慢慢倒入水中，不斷攪拌，操作時必須戴手套，口罩。6.96孔V型板和微量滴頭

5、清潔液的配制：重鉻酸鉀79克，水1000ml，硫酸100ml，將重鉻酸鉀磨碎，溶解于水中，然后慢慢加入硫酸100ml，不斷攪拌，切不可將重鉻酸鉀水溶液倒入硫酸中，以防爆炸，操作時必須戴手套，口罩。7.血清稀釋液：為滅菌的生理鹽水。三、實驗過程：原理：某些病毒（如新城疫、減蛋、流感）能夠與雞紅細胞發(fā)生凝集，此即為紅細胞凝集現(xiàn)象。這種紅細胞凝集現(xiàn)象可被特異性免疫血清所抑制，即紅細胞凝集抑制試驗（HI）。應用：1、檢測血清中的抗體水平，確定免疫時機。2、免疫后及時監(jiān)測，確認免疫效果。3、輔助診斷病毒性疾病。包括血凝（HA）試驗、抗原校正和血凝抑制（HI）試驗三步：（一）血凝（HA）試驗：采

6、用96孔V型反應板，測定抗原效價1、首先用微量移液器向反應板的每孔加生理鹽水25微升。2、用微量移液器吸取待測抗原25微升于第一孔中并擠壓6次混合，后吸出25微升至第2孔，依次倍比稀釋到第11孔，棄去25微升。3、微量移液器再吸取1%紅細胞懸液依次加入各孔，每孔25微升。4、置于微量振蕩器上振蕩1分鐘。5、室溫靜置30分鐘后觀察結果。6、結果觀察：將反應板傾斜成45度角，沉于孔底的紅細胞沿著傾斜面向下呈線狀流動者為沉淀，表明紅細胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細胞不流動，說明紅細胞被病毒所凝集。能使雞紅細胞完全凝集的抗原的最高稀釋倍數(shù)，稱為該

7、抗原滴度紅細胞凝集效價。即沉淀的前一孔即為該抗原的效價。如彩圖1所示第8孔紅細胞為完全凝集，說明該抗原效價為1：256。、圖1抗原效價為1：256（二）4單位抗原校正：1、根據(jù)抗原效價結果配制相應比例的抗原稀釋液：即4單位抗原。例：上圖1：抗原效價為1：256，HI試驗時，25微升抗原稀釋液內(nèi)須含4個凝集單位，則應將抗原作256/4=64倍稀釋。即取0.1毫升抗原，加入6.4毫升生理鹽水。2、首先用微量移液器向反應板的第二孔至第六孔加生理鹽水25微升。第一