血清蛋白分離、提純與鑒定

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1、血清清蛋白、γ-球蛋白的分離、提純于鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、掌握鹽析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法2、掌握凝膠層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法3、掌握離子交換層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法4、掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和基本方法5、了解柱層析技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理:蛋白質(zhì)的分離和純化是研究蛋白質(zhì)化學(xué)及其生物學(xué)功能的重要手段。對(duì)于不同的蛋白質(zhì),其分子量、溶解度及等電點(diǎn)等都有所不同。利用不同蛋白質(zhì)在這些性質(zhì)上的差別,利用相應(yīng)的物理方法可分離純化不同蛋白質(zhì)。A.鹽析法:在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性無(wú)機(jī)鹽后,由于中性鹽與水分子

2、的親和力大于蛋白質(zhì),致使蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜減弱乃至消失。同時(shí),加鹽后由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變,蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和,從而破壞了蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì),導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低,蛋白質(zhì)分子之間易于聚集沉淀,進(jìn)而使蛋白質(zhì)從水溶液中沉淀析出。B.凝膠層析:利用蛋白質(zhì)與無(wú)機(jī)鹽類之間分子量的差異。當(dāng)溶液通過(guò)SephadeG-25凝膠柱時(shí),溶液中分子直徑大的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入凝膠顆粒網(wǎng)孔,而分子量小的無(wú)機(jī)鹽能進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔中,因此在洗脫過(guò)程中,小分子的鹽會(huì)被阻滯而后洗脫出來(lái),從而達(dá)到去鹽的目的。C.離子交換層析:離子交換層析是指

3、流動(dòng)相中的離子和固定相上的離子進(jìn)行可逆的交換,利用化合物的電荷性質(zhì)及電荷量不同進(jìn)行分離。D.純度鑒定(醋酸纖維素薄膜電泳):血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同,一般都低于pH7.4。它們?cè)趐H8.6的緩沖液中均解離帶負(fù)電荷,在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于血清中各種蛋白質(zhì)分子大小、形狀及所帶的電荷量不同,因而在醋酸纖維素薄膜上電泳的速度也不同。因此電泳時(shí)可將它們分離為清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5條區(qū)帶。一、材料與方法A材料樣品:人混合血清試劑:葡聚糖凝膠(G-25)層析柱、DEAE纖維離子交換層

4、析柱、飽和硫酸銨溶液、醋酸銨緩沖溶液、20%磺基水楊酸、1%BaCl2溶液、氨基黑染色液、漂洗液、pH8.6巴比妥緩沖溶液、電泳儀、電泳槽B實(shí)驗(yàn)步驟鹽析(粗分離)→葡聚糖凝膠層析(脫鹽)→DEAE纖維素離子交換層析(純化)→醋酸纖維素薄膜電泳(純度鑒定)具體操作流程示意:(一)鹽析+凝膠柱層析除鹽:取血清0.8ml,邊搖邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液0.8ml,混勻室溫放置10min,4000r/min離心10min上清液(含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白)沉淀(含球蛋白)加水0.6ml溶解過(guò)葡聚糖凝膠G-25層析柱(

5、1.0×7cm)過(guò)葡聚糖凝膠G-25層析柱(1.0×7cm)用1ml0.02mol/LNH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/LpH6.5NH4AC緩沖液洗脫,流出液量約1ml時(shí)開始檢測(cè)蛋白質(zhì)用1ml0.02mol/LNH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/LpH6.5NH4AC緩沖液(2ml)洗脫,流出液量約1ml時(shí)開始檢測(cè)蛋白質(zhì)磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)收集含有蛋白質(zhì)的峰液12滴收集含有蛋白質(zhì)的峰液12滴繼續(xù)用2ml0.02mol/LNH4AC緩沖液洗滌繼續(xù)用2ml0

6、.02mol/LNH4AC緩沖液洗滌BaCl2檢測(cè)SO42-陰性BaCl2檢測(cè)SO42-陰性用2-3ml0.02mol/LNH4AC緩沖液再生平衡用2-3ml0.02mol/LNH4AC緩沖液再生平衡(二)離子交換層析(純化):除鹽后收集的球蛋白過(guò)DEAE-纖維素層析柱(1.0×6cm)用1ml0.02mol/LNH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/LpH6.5NH4AC緩沖液(3ml)洗脫,流出液量約1ml開始檢測(cè)蛋白質(zhì)取濃度最高的1管作純度鑒定(醋酸纖維素薄膜電泳法)磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)收

7、集含有蛋白質(zhì)的洗脫液每管10滴,連續(xù)收集3管除鹽后收集的清蛋白過(guò)DEAE-纖維素層析柱(1.0×6cm)DEAE-纖維素柱不用再生,可直接用于純化清蛋白用1ml0.06mol/LNH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,用約5mL0.06mol/LNH4AC緩沖液流洗,除去α球蛋白和β球蛋白磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)收集含有清蛋白的洗脫液每管10滴,連續(xù)收集2管DEAE-纖維素柱先用6mll.5mol/LNaCl-0.3mol/LNH4AC溶液流洗,再用10ml0.02mol/LNH4AC緩沖液流洗再生平衡2管均作純度鑒定(醋酸

8、纖維素薄膜電泳法)(三)醋酸纖維素薄膜電泳:1、點(diǎn)樣(如下圖):-點(diǎn)樣線+2cm點(diǎn)樣區(qū)(粗面)1.5cm點(diǎn)樣線盡量點(diǎn)得細(xì)窄而均勻,寧少勿多2、電泳:①薄膜粗面向下②點(diǎn)樣端置陰極端③兩端緊貼在濾紙鹽橋上,膜應(yīng)輕輕拉平電壓:110V時(shí)間:50min3、染色和漂洗:電泳完畢后,關(guān)閉電源,將膜取出,直接浸于染色液中5min。取出膜,盡量瀝凈染色液,移入漂洗液中浸洗脫色(一般更換2

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