核酸及核酸分子雜交1ppt課件

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1、第一章核酸的分子結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能主要內(nèi)容第一節(jié)核酸是遺傳物質(zhì)第二節(jié)核酸的結(jié)構(gòu)第三節(jié)核酸的功能第四節(jié)核酸的變性、復(fù)性和雜交第五節(jié)病毒核酸第六節(jié)反義核酸第一節(jié)核酸是遺傳物質(zhì)核糖核酸（RNA）脫氧核糖核酸（DNA）核酸Griffith1928年發(fā)現(xiàn)了DNA為遺傳物質(zhì)Avery1944年證明了DNA為遺傳物質(zhì)Watson和Crick1953提出了DNA雙螺旋第二節(jié)核酸的結(jié)構(gòu)一、DNA的結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)二、RNA的結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)DNA分子的脫氧核糖核苷酸殘基的排列順序三級(jí)結(jié)構(gòu)DNA中單鏈與雙鏈、雙鏈之間形成的三鏈或四鏈結(jié)構(gòu)拓?fù)浣Y(jié)

2、構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：正超螺旋、負(fù)超螺旋四級(jí)結(jié)構(gòu)：DNA與一些蛋白質(zhì)因子相互作用形成的結(jié)構(gòu)第三節(jié)核酸的功能一、DNA的功能二、RNA的功能(一)hnRNA和mRNA的功能(二)rRNA的功能（三）tRNA的功能(四)snRNA、scRNA（五）核酶第四節(jié)核酸的變性、復(fù)性和雜交一、核酸的變性二、核酸的復(fù)性三、核酸的雜交與應(yīng)用四、生物芯片——基因芯片三、核酸的雜交與應(yīng)用雜交含義：序列互補(bǔ)單鏈的RNA和DNA，或DNA與DNA，或RNA和RNA，根據(jù)堿基配對(duì)原則，借助氫鍵相連而形成雙鏈雜交分子的過(guò)程雜交Southern印跡Northern印跡Wes

3、tern印跡原位雜交雜交（一）探針及其標(biāo)記物（二）影響雜交的因素探針及其標(biāo)記物1、（核酸）探針（probe）：指帶有標(biāo)記物，能與被檢測(cè)的核苷酸片斷互補(bǔ)的一段已知核苷酸片斷。理想探針必須具備以下幾點(diǎn)：探針必須是一段已知的核苷酸序列必須加以標(biāo)記，便于雜交后檢測(cè)探針及其標(biāo)記物探針標(biāo)記物可分為放射性和非放射性?xún)纱箢?lèi)放射性核素標(biāo)記：32P、3H、35S等非放射性標(biāo)記物：（1）生物素：與UTP和dUTP嘧啶環(huán)的5位碳相連（2）光敏生物素（3）地高辛：類(lèi)固醇半抗原化合物，與嘧啶環(huán)相連（4）熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC）呈黃綠色熒光，試鹵靈呈現(xiàn)紅色熒光、

4、羥基香豆素呈現(xiàn)藍(lán)色熒光影響雜交的因素探針的濃度和長(zhǎng)度：濃度0.5-5.0ug/ml，探針長(zhǎng)度50-300bp雜交的溫度和時(shí)間：比Tm低20-25°C，雜交時(shí)間16h雜交液中的甲酰胺：降低雜交溶液溫度離子強(qiáng)度：〈0.1mol/LNa+，鹽濃度越高，雜交率越高非特異性雜交反應(yīng)：對(duì)非特異性位點(diǎn)進(jìn)行封閉，常用鮭魚(yú)精子DNA或小牛胸腺DNA；一些高分子化合物，如Denhardt氏溶液，脫脂奶粉Southern印跡具體步驟1、待測(cè)核酸制備2、限制性?xún)?nèi)切酶的消化3、瓊脂糖凝膠電泳4、原位DNA變性5、DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜6、預(yù)雜交7、雜交8、洗脫9、

5、放射自顯影3、瓊脂糖凝膠電泳分離大分子DNA片段（800~12000bp）用低濃度瓊脂糖（0.7%）凝膠分離小分子DNA片段（500~1000bp）用高濃度瓊脂糖（1%）凝膠分離300~500bpDNA片段用1.3%濃度瓊脂糖凝膠4、原位DNA變性將電泳后的DNA凝膠置于堿溶液中浸泡15min，使雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA然后，換到中和緩沖液中浸泡30min。5、轉(zhuǎn)移將DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上裁一張硝酸纖維素膜、2~4張濾紙和一些吸印紙，都與膠大小相同A．將長(zhǎng)的濾紙放在轉(zhuǎn)移平臺(tái)的頂部，濾紙兩端達(dá)到轉(zhuǎn)移盒的底部，做成虹吸橋。B．將80mL轉(zhuǎn)移

6、液倒入轉(zhuǎn)移盒內(nèi)，并濕潤(rùn)濾紙。C．將凝膠背面朝上置于濾紙搭成的橋上，凝膠與濾紙間避免有氣泡。D．用保鮮紙封住凝膠四邊。E．將浸濕的轉(zhuǎn)移膜置于凝膠的上部，凝膠與膜間避免有氣泡。F．將剩下的3張濾紙小心的放在轉(zhuǎn)移膜的上面，并放一疊吸水紙搭在濾紙上，再放一玻璃板，其上壓一重物G．轉(zhuǎn)移幾小時(shí)或過(guò)夜(至少4小時(shí))轉(zhuǎn)膜6、預(yù)雜交將膜上所有能與DNA和一些大分子物質(zhì)結(jié)合的位點(diǎn)全部封閉。一般用變性的非特異性DNA，如鮭魚(yú)精子DNA或小牛胸腺DNA。另一類(lèi)是用一些高分子化合物，一般用Denhardt氏溶液（含聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白），也可

7、以用脫脂奶粉7、雜交將放射性核素標(biāo)記的變性后DNA探針進(jìn)行雜交，雜交一般在較高的鹽濃度及適當(dāng)?shù)臏囟认逻M(jìn)行數(shù)小時(shí)或幾十小時(shí)核酸雜交流程圖Northern雜交與southern不同之處1、RNA在凝膠電泳時(shí)須經(jīng)變性處理2、電泳結(jié)束后，RNA不經(jīng)任何處理，可直接轉(zhuǎn)移到膜上3、RNA-DNA雜交不如DNA-DNA雜交強(qiáng)烈4、在RNA電泳中，18S和28S的大小可以作為一項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)RNA的質(zhì)量狀況四、基因芯片概念：基于堿基互補(bǔ)原理，在固體硅片或玻璃芯片表面用大量的基因探針按一定的序列集成的芯片基因芯片的主要類(lèi)型：基因芯片的雜交及檢測(cè)基因芯片的應(yīng)用基因芯

8、片的主要類(lèi)型根據(jù)支持物不同：無(wú)機(jī)片基和有機(jī)片基根據(jù)探針陣列的形式：原位合成和預(yù)先合成然后點(diǎn)樣根據(jù)芯片的功能：基因表達(dá)芯片和DNA測(cè)序芯片基因芯片的雜交及檢測(cè)雜交雜交