hplc方法開發(fā)

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1、系統(tǒng)方法開發(fā)開發(fā)方法之前應(yīng)明確以下各項分離目的樣品性質(zhì)和需要的預(yù)處理檢測方法開發(fā)分離方法的步驟選擇合適的HPLC方法開始建立方法改善分離檢查問題完善方法1有關(guān)樣品組分和性質(zhì)的重要信息現(xiàn)有組分的數(shù)目組分的結(jié)構(gòu)以及具有的官能團組分的分子量組分的pKa值樣品基質(zhì)的性質(zhì)：溶劑,填充物等要檢測組分在樣品中的濃度范圍樣品溶解度2分離目的是分析還是回收樣品組分？是否以知樣品所有成分的化學(xué)特性，即是否需要定性分析？是否需要解析出樣品的所有成分(例如,對映異構(gòu)體,非對映異構(gòu)體,同系物,低聚物,痕量雜物…)?如需定量分析，需要多高的精密度？3分離目的本法需用于幾種樣品劑型(如原料,制劑,環(huán)保樣品

2、等)？未來使用該方法分析的樣品數(shù)的多少？未來使用該方法的實驗室擁有的HPLC設(shè)備和技術(shù)能力？4樣品的性質(zhì)以及是否要進行預(yù)處理來自不同形態(tài)的樣品:可以直接進樣的溶液需要稀釋，緩沖，或者加入第二種溶劑的溶液能溶解在流動相中的固體物–配制樣品前應(yīng)稱重含有能引起柱效損失的物質(zhì)的樣品-要求萃取或過濾被分析物中含有不溶物-要求萃取或過濾5檢測方式根據(jù)不同的分離目的需要不同的檢測器.測量單個或少量的化合物時,理想的檢測器應(yīng)該僅僅對目標(biāo)物有響應(yīng)而對其他物質(zhì)沒有響應(yīng)–高選擇性和高靈敏度對于定性分析和制備色譜,理想的檢測器是通用型的檢測器,這樣混合物中的每一種物質(zhì)都能被檢測出來.–并且不需要特別

3、高的靈敏度6檢測器檢測器化合物類型UV/PDA最常用的檢測器不適用于烷烴和糖類RID通用型檢測器熒光檢測器適用于能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)具有高選擇性和靈敏度電化學(xué)檢測器適用于易氧化和降解的化合物具有高靈敏度和選擇性電導(dǎo)檢測器適用于可電離的化合物，如有機酸和無機酸柱前或柱后衍生化7選擇一種HPLC模式對于大多數(shù)的樣品，開發(fā)方法經(jīng)常是從反相模式開始的.離子對反相模式和正相模式是第二選擇.具有以下任何性質(zhì)的樣品經(jīng)常要求一些特殊的條件.大分子量的樣品,如聚合物,碳水化合物或蛋白質(zhì)含有光學(xué)異構(gòu)體的混合物(對映體)含有其他異構(gòu)體的混合物含有無機鹽的樣品8影響HPLC分離的反相條件不同分離條件優(yōu)先

4、選擇柱尺寸(長度,I.d.)15,25cmLx2-6mmID,粒徑3-5um固定相C-8orC-18流動相溶劑A/BWater/ACN%-B不定的緩沖液(化合物,pH,濃度)10-100mM磷酸鹽,pH2-7添加劑(eg.,離子對試劑,氨)陽離子中加1-20mM高氯酸鈉陰離子中加1-20mMTBA(四丁基銨）流速0.1-2ml/min溫度10-60oC樣品體積?100ul質(zhì)量?100ug9主要HPLC方法的特性方法/特點/色譜柱反相模式流動相：水/有機溶劑色譜柱:C-18(ODS),C-8,苯基,三甲基硅烷(TMS),氰基反相離子對模式流動相：水/有機溶劑,加一種緩沖液控制P

5、H值離子對試劑色譜柱:C-18(ODS),C-8,氰基正相模式流動相：有機溶劑混合液色譜柱:硅膠,氨基,氰基,二醇基何時應(yīng)用此方法對于能溶解于水/有機體系中的中性或非離子化合物，首選該模式離子或可電離的化合物,特別是堿性或陽離子化合物當(dāng)反相或離子對HPLC無效時的第二個較好選擇:首選為不溶解于水/有機混合液的親脂樣品、異構(gòu)體混合物和制備HPLC(硅膠最好)10離子交換模式流動相：水相，另以緩沖液控制pH值色譜柱:陽離子或陰離子交換柱尺寸排阻色譜流動相：水相(凝膠過濾)有機相(凝膠滲透)色譜柱:二醇基（凝膠過濾用）聚苯乙烯或硅膠（凝膠滲透用）分離無機離子混合物的首選(離子色譜法

6、)，分離核酸和蛋白質(zhì)以及有關(guān)的化合物的良好的選擇.分離高分子量樣品，如蛋白質(zhì)和聚合物的良好首選，也可用作測量G分子量的分布次要HPLC方法的特性方法/特點/色譜柱何時應(yīng)用此方法11改善分離兩個相鄰的峰達到基線分離，其分離度Rs>1.5.對簡單混合物，應(yīng)使分離度Rs>2對含10個或更多成分的樣品,分離度的要求可降到Rs>112開發(fā)HPLC方法的分離目的目的內(nèi)容分離度精密和抗干擾的定量分析要求Rs>1.5分離時間小于5-10min時，日常工作較理想定量含量測定：RSD<1%;要求不高或痕量分析,RSD<5%壓力最好<150kgf/cm2，<200kgf/cm2通常情況（假設(shè)是新柱

7、）峰形最好是信噪比大的窄峰溶劑消耗每個樣流動相的消耗量越小越好13檢查問題在方法開發(fā)期間，應(yīng)重視方法引起的問題柱效下降譜帶增寬樣品的溶劑不適合高壓引起的柱效下降高壓樣品前處理不當(dāng)流動相或其PH值不適合14完善方法方法本身在日常工作中應(yīng)經(jīng)受住考驗，應(yīng)適用于所有的有關(guān)實驗室HPLC方法必須嚴(yán)格適合下列標(biāo)準(zhǔn)精確度準(zhǔn)確度穩(wěn)定性可轉(zhuǎn)移性方法有效性檢查對方法開發(fā)來說是非常重要的15開發(fā)HPLC方法的步驟1.有關(guān)樣品的信息,明確分離目的2.是否需要特殊的HPLC步驟、樣品預(yù)處理等.3.選擇檢測器和檢測器設(shè)備4.選擇L