具有抑菌活性桑樹內(nèi)生菌分離鑒定及其抑菌物質(zhì)的研究

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1、分類號：Q939.92密級：公開學號：092300010理學碩士學位論文具有抑菌活性的桑樹內(nèi)生菌的分離鑒定及其抑菌物質(zhì)研究學生姓名譚廣秀指導教師吳瓊英副教授江蘇科技大學二〇一二年六月AThesisSubmittedinFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceIsolationandIdentificationofAntimicrobialEndophyteandItsAntimicrobialSubstancesSubmittedbyTanGuangXiuSupervisedbyProfesso

2、rWuQiongYingJiangsuUniversityofScienceandTechnologyJune2012江蘇科技大學學位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學位論文，為本人在導師的指導下，獨立進行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔。學位論文作者簽名：年月日江蘇科技大學學位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學位論文作者完全了解學校有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定，同意學校保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送

3、交論文的復印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)江蘇科技大學可以將本學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存和匯編本學位論文。本學位論文屬于：(1)保密□，在年解密后適用本授權(quán)書。(2)不保密□。學位論文作者簽名：指導教師簽名：年月日年月日摘要摘要植物內(nèi)生菌是一個多樣性豐富而復雜的微生物類群。研究發(fā)現(xiàn)，植物中內(nèi)生菌可產(chǎn)生抗腫瘤、抑菌和殺蟲等生物活性物質(zhì)，是開發(fā)新天然藥物的潛在來源。本文中，以大腸桿菌為指示菌，從魯桑桑枝組織中分離具有抑菌活性的內(nèi)生菌，并通過形態(tài)學、生理生化特征和16SrRNA基因序列分析對其進行鑒定；

4、在單因素的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)曲面分析法對該菌株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化；通過乙酸乙酯萃取和硅膠層析等方法分離純化該菌株發(fā)酵產(chǎn)物中的抑菌物質(zhì)，并利用氣相-質(zhì)譜分析儀對抑菌物質(zhì)的進行結(jié)構(gòu)分析；通過紫外光譜、紅外光譜和透射電鏡等方法對該菌株的抑菌機理進行初步研究。取得以下研究結(jié)果：從魯桑桑枝組織中分離得到75株內(nèi)生菌，其中，內(nèi)生真菌49株，內(nèi)生細菌26株；篩選出2株具有抑菌活性的內(nèi)生菌ME1和ME2。形態(tài)學和生理生化特征表明：菌株ME1是具有鞭毛和芽孢，無莢膜的革蘭氏陽性菌，細胞呈桿狀，大小0.6～0.7μm×1.8～1.9μm；能夠利用葡萄糖、蔗糖、乳糖和淀粉，不能利用酪蛋白；菌

5、株ME2是具有鞭毛和芽孢，無莢膜的革蘭氏陽性菌，細胞呈桿狀，大小0.6～0.7μm×1.5～1.6μm；能夠利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉和酪蛋白。依據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，初步鑒定菌株ME1和ME2為芽孢桿菌。通過16SrRNA基因序列分析，最終鑒定菌株ME1（GenBank登錄號：JQ900635）和ME2（GenBank登錄號：JQ900623）為Bacillussubtilis。本文中，響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化出菌株ME1的最優(yōu)培養(yǎng)基組成為：馬鈴薯浸提物6.04g/L、葡萄糖30.80g/L、硝酸銨10.20g/L、氯化鈣19.80g/L；最

6、優(yōu)發(fā)酵參數(shù)為：接種量2%，裝液量50%，培養(yǎng)基初始pH7.08，發(fā)酵時間72h，發(fā)酵溫度27.9℃，轉(zhuǎn)速152r/min。在此條件下，ME1菌株發(fā)酵產(chǎn)物對大腸桿菌的抑制圈直徑為24.27mm。氣相-質(zhì)譜分析結(jié)果表明：菌株ME1發(fā)酵產(chǎn)物中主要存在(2,5-二甲基-1-對氯苯基-3-亞甲基)-N-(5-異喹啉基)胺、3,6-二丁基-1,2-二氫-1,2,4,5-四嗪、4,4a,5,6,7,8,9,9a-八氫-10,10-1,4-甲醇-1H-環(huán)庚烷[d]噠嗪、壬二酸-二(2-甲基丙基)酯和2,4-二[P–氯苯乙烯基]-5-硝基噻唑等具有抑菌活性的化合物。菌株ME1的發(fā)酵液粗

7、提物（Extr.01）能夠抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在對數(shù)期中的生長；通過對指示菌（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）培養(yǎng)液進行紫外光譜和紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，ME1的發(fā)酵液粗提物（Extr.01）能夠促使指示菌細胞內(nèi)溶物外泄。透射電子顯微鏡觀察表明ME1的發(fā)酵液粗提物（Extr.01）能夠破壞指示菌（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）細胞壁和細胞膜結(jié)構(gòu)，使其細胞膜和細胞壁通透性增強，引起細胞內(nèi)容物外泄，最終導致細胞死亡。I江蘇科技大學理學碩士學位論文關(guān)鍵詞桑樹；內(nèi)生菌；抑菌活性；分離與鑒定；發(fā)酵條件；純化；抑菌機理IIAbstractAbstractRecently