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《新生小鼠精原干細胞誘導分化精子樣細胞》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在工程資料-天天文庫。
1、新生小鼠精原干細胞誘導分化精子樣細胞：畢聰明，王珅，王軍，費東亮，肖銀霞【摘要】 目的探討小鼠精原干細胞體外誘導分化精子樣細胞的可行性。方法以7～8日齡小鼠睪丸為材料，采用小鼠睪丸支持細胞作為飼養(yǎng)層，應用維甲酸誘導、成年小鼠睪丸組織液誘導以及低溫誘導精原干細胞分化，應用流式細胞儀分析誘導精子樣細胞的染色體倍性。采用顯微注射法將精子樣細胞注射到卵母細胞和去核卵母細胞，觀察受精卵的發(fā)育狀況。結果三種方法誘導精子樣細胞比例分別為5.9%、1.6%、0.35%；流式細胞儀分析維甲酸誘導單倍體比率為19.3%；誘導精子樣細胞能激活卵母細胞，囊胚發(fā)育率20.36%。結論新生小鼠精原干細胞體外
2、可以誘導分化為精子樣細胞，并具有激活卵母細胞的能力?！娟P鍵詞】精原干細胞分化單倍體小鼠 Abstract:ObjectiveTodiscussthepossibilityofSSCsofNeiceinducingthedifferentiatingSperm-likecells.MethodsTakingthetestisofmalemiceof7～8daysformaterialandadoptingthetestisofmice,SSCsdifferentiatingiceandloperature.Floetryosomeinducingsperm-likecells.Mi
3、croinjection-likecellsintooocytesandenucleateoocytestoobservethedevelopmentsituationofzygotes.ResultsTheproportionsofsperm-likecellsinducedbythethreemethodsetrytoanalyseretinoicacidhaploidis19.3%.Thesperm-likecellsachievedcouldactivatebovineoocytesbysperminjection(ICSI),andthedevelopmentrateof
4、blastosphereicecanbeinducedanddifferentiatedintosperm-likecellsandarealsocapableofactivatingoocytes. Keyice 在生精過程中，原始生殖細胞在胚胎期遷移到生殖嵴，經有絲分裂，迅速增殖形成精原干細胞（spermatogoialstemcells，SSCs），然后進一步形成精原細胞。吳應積等［1］利用曲細精管體外共培養(yǎng)法長期培養(yǎng)精原干細胞自分化為精子樣細胞，另外應用外源基因修飾的雄性生殖細胞系或青春期的精原干細胞也可分化出精子樣細胞［2－5］，通過體內移植使無內源性精子的動物產生精
5、子。但在體外研究SSCs誘導精子的很少，某些雄性性原細胞可以直接分化成精原細胞［6］，這提示具有一少部分雄性性原細胞維持在干細胞狀態(tài)。本實驗通過體外誘導新生小鼠SSCs分化為精子樣細胞，探討不同誘導方法的誘導效率；采用顯微注射法將精子樣細胞注射到卵母細胞和去核卵母細胞，探討其體外重構胚的發(fā)育能力，為SSCs體外分化研究打下基礎?！ ?材料與方法 1.1動物與材料 1.1.1實驗動物清潔級7～8日齡雄性昆明乳鼠(遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供)?！ ?.1.2材料碘化丙錠（propidiumiodide，PI）維甲酸（retinoicacid，RA）、EGF（epidermalgro
6、ulatinghormone）均為SIGMA公司產品?！ ?.1.3培養(yǎng)液的配制 A基礎培養(yǎng)液DMEM+10%FBS培養(yǎng)液+6mM谷氨酰胺+0.5mM丙酮酸鈉+0.1%非必需氨基酸+10ng/mLEGF+10ng/mL類胰島素樣生長因子+500ng/mL促卵泡生成素+133mIU人生長激素+5mg/mL胰島素+5mg/mL轉鐵蛋白+5mM維生素A+0.1mM視黃醛+0.1mM睪酮+0.1mM二氫睪酮+0.01%核苷+0.5%青霉素。 B條件培養(yǎng)液基礎培養(yǎng)液+30%成年小鼠睪丸組織浸提液。 1.2方法 1.2.1SSCs的獲取 采用組合酶消化法分離SSCs，采用支持細胞和S
7、SCs共培養(yǎng)的方法培養(yǎng)，接種密度為1.0×105/mL，每周換液體2次?！ ?.2.2SSCs的誘導 A.RA誘導原代培養(yǎng)用基礎培養(yǎng)液，添加10-5mol/LRA處理48h，培養(yǎng)4d，更換為基礎培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)，定時觀察細胞生長狀況，顯微鏡觀察照相?！ .條件培養(yǎng)液誘導原代培養(yǎng)用基礎培養(yǎng)液培養(yǎng)，3d換上條件培養(yǎng)液（50%細胞基礎培養(yǎng)液+50%睪丸組織浸提液培養(yǎng)液），37℃培養(yǎng)，每2～3d半量換液1次，定時觀察細胞生長狀況，顯微鏡觀察照相?！ .低溫培養(yǎng)誘導原代
