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1、油污土壤中脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化曲威，邵蕾，宋麗芬，徐榕雪（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院，山東煙臺２６４６７０）摘要：為了獲得脂肪酶產(chǎn)生菌，進而獲得高酶活菌株，試驗采集東營勝利油田被廢油長期污染的土壤，通過羅丹明Ｂ平板法進行菌株分離篩選，并采用橄欖油乳化法測定脂肪酶酶活。經(jīng)１６ＳｒＲＮＡ鑒定，確定為銅綠假單胞菌屬，命名為ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａＳ８。并對該菌株的搖床培養(yǎng)產(chǎn)酶條件進行了初步研究，采用單因素試驗和正交試驗對Ｓ８菌株產(chǎn)脂肪酶的條件進行優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基與條件為葡萄糖８ｇ
2、／Ｌ，酵母粉８ｇ／Ｌ，硫酸銨６ｇ／Ｌ，花生油２０ｇ／Ｌ，起始ｐＨ７．０，接種量９％，溫度３０℃，發(fā)酵培養(yǎng)時間７２ｈ，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了出發(fā)菌株。..關(guān)鍵詞：脂肪酶；銅綠假單胞菌；篩選；鑒定；優(yōu)化中圖分類號：ＴＱ９２５＋．６；Ｑ５５６＋．１文獻標(biāo)識碼：Ａ：０４３９－８１１４（２０１５）１６－４００２－０５ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．１６．０４４收稿日期：２０１４－１２－１６基金項目：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院科研基金項目（ＹＴ２０１１０２）簡介：曲威（１９８２－）
3、，女（滿族），遼寧撫順人，助理研究員，博士，主要從事微生物資源研究，（）１３８５３５５５１３３（電子信箱）ｑｕｗｅｉ０５０６＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ；通信，徐榕雪（１９８２－），女，山東煙臺人，助理研究員，博士，主要從事生物資源研究，（電子信箱）ｘｕｒｏｎｇｘｕｅ１９８２＠ａｌｉｙｕｎ．ｃｏｍ。脂肪酶（ｌｉｐａｓｅ，ＥＣ３．１．１．３）是一類廣泛存在于微生物和動植物細胞中的水解酶，能在油水界面催化甘油三酯生成甘油及脂肪酸［１］，因其在非水相條件下催化反應(yīng)可逆，可用于催化醇解、酯化和酯交換反應(yīng)［２］。生物的
4、脂肪酶由于反應(yīng)條件緩和，對環(huán)境污染小，成本低，被廣泛應(yīng)用于食品、制革、飼料、洗滌和油脂水解等工業(yè)領(lǐng)域［３，４］，并且在生物柴油的制備、地溝油的回收利用等方面有不可替代的應(yīng)用價值［５］。在自然界中，脂肪酶主要存在于動物胰臟、植物種子和微生物中，由于微生物種類多、繁殖快，并且所產(chǎn)生的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，比動物脂肪酶酶解作用的ｐＨ和溫度范圍更寬［６］，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)和獲得高純度樣品，因此微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要。本研究從山東東營勝利油田附近被廢油長期污染的土壤中成功篩選出一株產(chǎn)脂肪酶效果較好
5、的菌株，經(jīng)過鑒定，確定為銅綠假單胞菌，命名為ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａＳ８，并對其產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，得到該菌產(chǎn)酶的最佳發(fā)酵條件，以期為脂肪酶的生產(chǎn)提供優(yōu)良酶源。１材料與方法１．１材料土樣：采自東營勝利油田被廢油嚴重污染的土壤，共１６份。富集培養(yǎng)基：酵母粉２ｇ／Ｌ，橄欖油１０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４３ｇ／Ｌ，Ｎａ２ＨＰＯ４１ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／Ｌ，ｐＨ７．０。篩選培養(yǎng)基：酵母粉２ｇ/Ｌ，橄欖油乳化液２０ｇ/Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４２ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ０．０５ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４
6、０．１５ｇ／Ｌ，Ｎａ２ＨＰＯ４０．３５ｇ／Ｌ，瓊脂２ｇ／Ｌ，羅丹明Ｂ０．００５ｇ／Ｌ（過濾除菌），ｐＨ７．０。橄欖油與聚乙烯醇（體積分數(shù)為２％）以１∶３（體積比）的比例混合，攪動乳化５ｍｉｎ，即成乳白色聚乙烯醇橄欖油乳化液［７］。種子培養(yǎng)基：蛋白胨２ｇ／Ｌ，葡萄糖２ｇ／Ｌ，酵母粉２ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ３ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ／Ｌ，ｐＨ７．０。發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨２ｇ／Ｌ，葡萄糖２ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４１ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ１ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４１ｇ／Ｌ，ｐＨ７．０。碳源篩選培養(yǎng)基：酵母粉２ｇ/Ｌ，（
7、ＮＨ４）２ＳＯ４２ｇ/Ｌ，ＮａＣｌ０．０５ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４０．１５ｇ／Ｌ，Ｎａ２ＨＰＯ４０．３５ｇ／Ｌ，ｐＨ７．０，分別加入蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖作為碳源。氮源篩選培養(yǎng)基：葡萄糖２ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ０．０５ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４０．１５ｇ／Ｌ，Ｎａ２ＨＰＯ4０．３５ｇ／Ｌ，ｐＨ７．０，分別加入酵母粉、蛋白胨、尿素、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＫＮＯ３作為氮源。１．２試驗方法１．２．１產(chǎn)脂肪酶菌種篩選１）富集培養(yǎng)。每種土樣稱量５.0ｇ，加入２０ｍＬ無菌水，振蕩制成土壤懸液。取每種土壤懸液各５ｍＬ加入裝
8、有３０ｍＬ富集培養(yǎng)基的三角瓶中，將三角瓶置于３０℃搖床振蕩培養(yǎng)３ｄ。富集3次。２）初篩培養(yǎng)。將過濾滅菌的羅丹明Ｂ加入到已滅菌的初篩培養(yǎng)基中，倒平板。從富集培養(yǎng)的菌液中取1ｍＬ菌液，用去離子水進行系列梯度稀釋后涂布在平板中，３０℃培養(yǎng)３ｄ后，在３５０ｎｍ紫外光下觀察，產(chǎn)生脂肪酶的菌株周圍會出現(xiàn)熒光圈，且這種熒光圈越大，脂肪酶活越高。依據(jù)培養(yǎng)平板上形成的熒光圈大小進行菌種篩選。３）復(fù)篩培養(yǎng)。挑取初篩培養(yǎng)基上菌落周圍變
