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《質(zhì)粒的提取和鑒定,dna酶切》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、堿變性法小量提取質(zhì)粒，DNA的限制性酶切廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)組實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諌A變性法提取質(zhì)粒DNA的方法。掌握質(zhì)粒酶切鑒定原理,學(xué)會(huì)根據(jù)目的基因和實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適載體與限制性內(nèi)切酶，設(shè)計(jì)構(gòu)建體外重組分子。質(zhì)粒(plasmid)是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器（主要指線粒體和葉綠體）和細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的DNA分子，在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器（主要指線粒體和葉綠體）和細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的DNA分子，在基
2、因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。分離質(zhì)粒DNA的基本步驟培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離和純化質(zhì)粒DNA質(zhì)粒DNA的提取方法堿變性法（堿裂解法）；煮沸裂解法；羥基磷灰石柱層析法；質(zhì)粒DNA釋放法；酸酚法等。堿變性（裂解）法基本原理：在堿性條件下（pH12.6），染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，質(zhì)粒DNA氫鍵也大部分?jǐn)嗔?，雙螺旋也有部分解開，但共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)以pH4.8的乙酸鈉將其pH調(diào)到中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來的構(gòu)型，而染色體DNA不能復(fù)性，形
3、成纏繞的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，離心后，由于浮力密度不同，染色體DNA與大分子RNA、蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。原理示意圖質(zhì)粒DNA電泳電場(chǎng)中DNA分子的遷移速度取決于：DNA分子本身的大小DNA分子的空間構(gòu)型超螺旋構(gòu)型（ccDNA)線形DNA(lDNA)開鏈環(huán)狀DNA(ocDNA)復(fù)制中間體（沒有復(fù)制完的兩個(gè)質(zhì)粒連在一起)溴化乙錠（EB）是一種熒光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴鹽)，其分子可以嵌入到核酸的堿基對(duì)之間，在紫外線的激發(fā)下，發(fā)出橙色熒光Attention,please!EB是
4、強(qiáng)誘變劑，配制和使用EB染色液時(shí)，應(yīng)帶乳膠手套或一次性手套，并且不要將該染色液灑在桌面或地面上，凡是沾污EB的器皿或物品，必須進(jìn)行清洗或棄去！質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)材料與試劑實(shí)驗(yàn)材料：過夜培養(yǎng)大腸桿菌DH-5a實(shí)驗(yàn)試劑：LB培養(yǎng)基0.1MNaCL、10mMTris.CL（pH8.0）、1mMEDTA、Amp50mg/ml、酚、氯仿、Rnase、瓊脂糖TE：10mMTris.CL（pH8.0），1mMEDTA溶菌酶10mg/ml（用10mMTris.CL，pH8.0，新鮮配制）溶液Ⅰ—溶菌液：50mM葡萄糖，25mMT
5、ris.Cl（pH8.0），10mMEDTA，2mg/ml溶菌酶。溶液Ⅱ—NaOH-SDS液：0.2NNaOH，1%SDS。溶液Ⅲ—3mol/LNaAc（pH4.8）溶液：5MKAC10ml，冰醋酸11.5ml，水28.5ml。步驟一細(xì)菌培養(yǎng)與質(zhì)粒擴(kuò)增1.挑單克隆E.coli菌株接種到4mlLB培養(yǎng)液中（含Amp50μg/ml），37℃225rpm振蕩培養(yǎng)過夜。（活化菌種）2.從中取2ml種子菌液于含Amp培養(yǎng)基500ml中，37℃振蕩培養(yǎng)3-4小時(shí)（OD600＝1.0）3.取4ml培養(yǎng)液至Eppendor
6、f管中，12000rpm，4℃離心30秒，棄上清，用1mlSTE懸浮菌體，再離心回收菌體，并重復(fù)一次，棄上清，取沉淀。步驟二質(zhì)粒提取取4ml培養(yǎng)物至Eppendorf管中，12000rpm，4℃，離心30sec，棄上清。用1mlSTE懸浮菌體，再離心回收菌體，并重復(fù)一次，棄上清取沉淀，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥。將細(xì)菌沉淀懸浮于100μl預(yù)冷的溶液I中，加入10μl溶菌酶（10mg/ml），劇烈振蕩均勻，冰上放置1分鐘。加200μL溶液II（新鮮配制），蓋緊Eppendorf管，快速輕柔顛倒5次，混勻內(nèi)容物，將E
7、ppendorf管放在冰上3分鐘。5.加入150μL溶液III（冰上預(yù)冷），蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻，冰上放置5min。6.12000rpm，4℃離心5min，將上清夜轉(zhuǎn)至另一1.5mlEppendorf管中。7.加入等體積酚/氯仿（1：1），振蕩混勻，室溫放置5-10min，12000rpm，4℃下離心2分鐘，倒去上清，把Eppendorf管倒扣在吸水紙上，吸干液體。8.加入2倍體積冰預(yù)冷無水乙醇，振蕩混勻，12000rpm4℃離心5分鐘。9.倒去上清，加入1ml冰預(yù)冷70%乙醇振蕩漂洗DNA沉淀。120
8、00rpm，4℃離心2分鐘。10．棄上清并盡量吸除液體，打開管蓋，室溫放置5min。室溫放置15min干燥。11．50μlTE緩沖液(含無DNase的RNase20μg/ml)，使DNA完全溶解（-20℃保存）12．取樣品10μl加2ul6×Loadingbuffer于1%瓊脂糖電泳，電泳凝膠在凝膠成像系統(tǒng)上成像。MpBSKpGFP菌體老化堿裂解不充分菌體中無質(zhì)粒溶液使用不當(dāng)請(qǐng)涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液
