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1、昆蟲線粒體基因組研究方法一.昆蟲線粒體基因組的研究意義(一)適合做進(jìn)化生物學(xué)研究。被廣泛用于研究基因組結(jié)構(gòu)和功能、群體遺傳結(jié)構(gòu),譜系地理學(xué)和各種分類學(xué)水平上的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究。(二)功能基因的研究二.研究方法(一)獲取待研究昆蟲的線粒體基因組(二)對線粒體基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(三)與其他昆蟲線粒體基因組進(jìn)行比對(四)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析具體步驟1.采集標(biāo)本并冷凍2.提取DNA3.擴(kuò)增線粒體基因組上的經(jīng)典片段4.設(shè)計引物,擴(kuò)增其他片段5.將所有片段拼接成完整的線粒體組(環(huán)形)6.校對數(shù)據(jù),利用軟件、比對等
2、方法,標(biāo)出tRNA、16S、12S及13個蛋白質(zhì)基因的位置,上傳線粒體基因組數(shù)據(jù)至Genbank。7.對tRNA進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測8.對12S及16S進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測9.對該昆蟲線粒體基因組上特殊位置進(jìn)行討論10.系統(tǒng)發(fā)育分析1.采集標(biāo)本及冷凍利用高壓汞燈及黑光燈誘集,然后將標(biāo)本低溫冷凍致死,取一側(cè)后足泡入無水乙醇,置于-20度冰箱保存,供提取DNA。標(biāo)本展翅并保存,以待進(jìn)一步形態(tài)鑒定。2.DNA提取總DNA提取試劑盒為德國默克公司QIAGENDNeasyTissuekit。PCR試劑使用TIANGEN天根
3、生化科技有限公司生產(chǎn)的PCRMasterMix。將浸泡于無水乙醇中的足取出,晾干,分成2-3段,放在1.5ul的離心管中。按照QIAGENDNeasyTissuekit使用手冊的說明進(jìn)行總DNA提取。抽提的DNA溶于200-300ul的AE緩沖液,并置于在-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.PCR擴(kuò)增和測序先擴(kuò)增線粒體基因組上的經(jīng)典片段,如COⅠ、COⅡ、COⅢ、Cob等。例:擴(kuò)增COI基因片段擴(kuò)增引物為通用引物L(fēng)COI490(5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’)和HCO2198
4、(5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’)(Folmeretal,1994)。反應(yīng)體系為25μl,其中上下游引物各0.5μl,PCRMasterMix12.5μl,DNA模板3μl,ddH2O8.5μl。擴(kuò)增反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃2分鐘,變性94℃1分鐘,退火50℃1分鐘,延伸72℃1分鐘,進(jìn)行35個循環(huán)。取3μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖膠電泳檢驗。PCR產(chǎn)物測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。4.設(shè)計引物,擴(kuò)增其他片段利用軟件Primer5.0設(shè)計引物,擴(kuò)
5、增其他片段。最難擴(kuò)增的片段是控制區(qū)(A+T-rich)。因為引物很難設(shè)計,所以需要花費一些時間及精力。5.將所有片段拼接成完整的線粒體組(環(huán)形)利用軟件DNAstar對擴(kuò)增好的各個片段進(jìn)行拼接。用Bioedit軟件查看測序原始峰圖,校對各個堿基。將校對好的數(shù)據(jù)上傳至Genbank。獲取Genbank的accessionnumber。6.尋找tRNA及預(yù)測tRNA結(jié)構(gòu)用tRNAscan-SESearchServer在線軟件,尋找tRNA,一次可找出17-19個。其余與其他昆蟲線粒體進(jìn)行比對找出。用D
6、NAsis預(yù)測tRNA結(jié)構(gòu),對于較為特殊的tRNASer(AGN),需手工畫出。7.預(yù)測12S及16S結(jié)構(gòu)用軟件XRNA進(jìn)行預(yù)測。預(yù)測不到的,用手工畫出。8.對特殊結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析討論例:控制區(qū)的結(jié)構(gòu)分析在線軟件MfoldWebServer(Zuker,2003;http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold)9.系統(tǒng)發(fā)育分析用軟件MEGA5.0,RAxML,Paup4.0,mrbayes等軟件進(jìn)行分析