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1、1.微生物代謝工程定義、研究內容和研究手段。定義:通過某些特定生化反應的修飾來定向改善細胞的特性功能,運用重組DNA技術來創(chuàng)造新的化合物。研究內容:生物合成相關代謝調控和代謝網絡理論;代謝流的定量分析;代謝網絡的重新設計;中心代謝作用機理及相關代謝分析;基因操作。研究手段:代謝工程綜合了基因工程、微生物學、生化工程等領域的最新成果。因此,在研究方法和技術方面主要有下列三大常用手段:(1)檢測技術:常規(guī)的化學和生物化學檢測手段都可用于代謝工程的研究,如物料平衡、同位素標記示蹤法、酶促反應動力學分析法、光譜學法、生物傳感器技術。(2)
2、分析技術:采用化學計量學、分子反應動力學和化學工程學的研究方法并結計算機技術,闡明細胞代謝網絡的動態(tài)特征與控制機理,如穩(wěn)態(tài)法、擾動法、組合法和代謝網絡優(yōu)化等。(3)基因操作技術:在代謝工程中,代謝網絡的操作實質上可以歸結為基因水平上的操作:涉及幾乎所有的分子生物學和分子遺傳學實驗技術,如基因和基因簇的克隆、表達、調控,DNA的雜交檢測與序列分析,外源DNA的轉化,基因的體內同源重組與敲除,整合型重組DNA在細胞內的穩(wěn)定維持等。2.代謝改造思路和代謝設計原理。代謝改造思路:根據微生物的不同代謝特性,常采用改變代謝流、擴展代謝途徑和構
3、建新的代謝途徑三種方法。(1)改變代謝途徑的方法:加速限速反應,增加限速酶的表達量,來提高產物產率。改變分支代謝途徑流向,提高代謝分支點某一分支代謝途徑酶活力,使其在與其它的分支代謝途徑的競爭中占據優(yōu)勢,從而提高目的代謝產物的產量。(2)擴展代謝途徑的方法:在宿主菌中克隆和表達特定外源基因,從而延伸代謝途徑,以生產新的代謝產物和提高產率。擴展代謝途徑還可使宿主菌能夠利用自身的酶或酶系消耗原來不消耗的底物。(3)轉移或構建新的代謝途徑:通過轉移代謝途徑、構建新的代謝途徑等方法來實現。代謝設計原理:現存代謝途徑中改變增加目的產物代謝流
4、:增加限速酶編碼基因的拷貝數;強化關鍵基因的表達系統(tǒng);提高目標途徑激活因子的合成速率;滅活目標途徑抑制因子的編碼基因;阻斷與目標途徑相竟爭的代謝途徑;改變分支代謝途徑流向;構建代謝旁路;改變能量代謝途徑;在現存途徑中改變物流的性質:利用酶對前體庫分子結構的寬容性;通過修飾酶分子以拓展底物識別范圍;在現存途徑基礎上擴展代謝途徑:在宿主菌中克隆、表達特定外源基因可以延伸代謝途徑,從而生產新的代謝產物、提高產率。3.微生物的基因操作技術有哪些?(舉兩例說明)微生物的基因操作技術有:核酸的凝膠電泳、核酸的分子雜交技術、DNA序列分析、基因
5、的定點誘變、細菌的轉化、利用DNA與蛋白質的相互作用進行核酸研究、PCR技術等?;蚨c突變(site-directedmutagenesis):通過改變基因特定位點核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列,用于研究氨基酸殘基對蛋白質的結構、催化活性以及結合配體能力的影響,也可用于改造DNA調控元件特征序列、修飾表達載體、引入新的酶切位點等。主要采用兩種PCR方法,包括重疊延伸技術和大引物誘變法。在硫化細菌核苷水解酶對底物專一性的研究中,采用定點突變技術,對編碼221位和228位氨基酸的DNA序列進行突變,改變兩個位點的氨基酸,從而研究
6、氨基酸殘基對底物結合的影響?;蚯贸?geneknock-out):又稱基因打靶,通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組,進行精確的定點修飾和基因改造,具有專一性強、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點,可分為完全基因敲除和條件型基因敲除。在谷氨酸棒桿菌生產纈氨酸的研究中,采用基因敲除的方法進行高產菌株構建。如ilvA基因敲除,使蘇氨酸脫氨酶的合成減少,降低異亮氨酸合成的前體,從而減少異亮氨酸的合成,增加纈氨酸的生成。4.什么是酶的反饋抑制,以纈氨酸代謝途徑來舉例說明。酶的反饋抑制:指最終產物抑制作用,即在合成過程中有生
7、物合成途徑的終點產物對該途徑的酶的活性調節(jié),所引起的抑制作用,包括順序反饋抑制、同工酶的反饋抑制、協(xié)同反饋抑制、累積反饋抑制、增效反饋抑制。以纈氨酸為例:纈氨酸由丙酮酸合成,涉及四個反應,分別由四個酶催化,依次為乙酰羥酸合酶(AHAS)、乙酰羥酸同分異構酶(AHAIR)、二羥酸脫水酶(DHAD)和支鏈氨基酸轉氨酶(TA)。首先,由AHAS將兩分子丙酮酸縮合成2-乙酰乳酸;其次,AHAIR將2-乙酰乳酸轉化為雙羥基異戊酸;再次,由DHAD將雙羥基異戊酸脫水形成2-酮異戊酸;最后,TA將2-酮異戊酸轉化為L-纈氨酸。L-纈氨酸和L-異
8、亮氨酸的合成共享AHAS、AHAIR、DHAD和TA等4種酶。如AHAS以丙酮酸為底物則合成L-纈氨酸,而用丙酮酸和2-酮丁酸為底物則合成L-異亮氨酸。纈氨酸合成反饋抑制的主要對象是其合成途徑上的第一個關鍵酶乙酰羥酸合酶(AHAS),同時纈氨酸和異