rna提取方法及原理

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1、RNA提取方法及原理John1、研究背景1.1RNA研究的重要性DNA，RNA和蛋白質(zhì)是三種重要的生物大分子，是生命現(xiàn)象的分子基礎(chǔ)。DNA的遺傳信息決定生命的主要性狀，而mRNA在信息傳遞中起很重要的作用。其它兩大類RNA，rRNA和tRNA，同樣在蛋白質(zhì)的生物合成中發(fā)揮不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遺傳信息由DNA傳遞到表現(xiàn)生命性狀的蛋白質(zhì)的過程中舉足輕重。1.2RNA分布不同豐度組織名稱樣品量總RNA含量高豐度肝臟1mg2-4μg脾臟1mg心臟1mg中豐度大腦1mg0.05-

2、2μg胚胎1mg腎臟1mg肺1mg低豐度膀胱1mg0-0.05μg骨1mg脂肪1mg高豐度成纖細(xì)胞1050.5-1μg人白細(xì)胞105中豐度酵母1050.5-1.5μg擬南芥葉片1mg0.2-0.5μg低豐度煙草葉片1mg0.05-0.1μg玉米葉片1mg2、方法及原理2.1RNA的提取流程1、樣本前處理2、細(xì)胞裂解3、RNA的純化及獲得RNA提取流程－－樣品前處理注意點選擇新鮮血液，不得超過4小時選擇新鮮的幼嫩組織選擇處于生長旺盛的時期收集細(xì)胞選擇新鮮組織，生長旺盛的組織可將新鮮血液先進(jìn)行紅細(xì)胞裂解，得

3、到的白細(xì)胞然后加入一定量的TRNzol，-70℃保存較長時間去掉培養(yǎng)基，加入一定量TRNzol-70℃保存較長時間推薦使用專門的RNA樣品儲存液進(jìn)行儲存液氮或加入RNase抑制劑中保存，避免反復(fù)凍融RNA提取流程－－樣品前處理中如何保存樣本RNA提取流程－－細(xì)胞裂解，以釋放RNA異硫氰酸胍/酚－TRNzol總RNA提取試劑獨特配方--RNAplant植物RNA提取試劑胍鹽/β-巰基乙醇—RNAprep系列RNA提取試劑盒RNA提取流程－－RNA的純化及獲得RNA純化要求1純化后不應(yīng)存在對酶(如逆轉(zhuǎn)錄酶)

4、有抑制作用物質(zhì)2排除有機溶劑和金屬離子的污染3蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子等的污染降低到最低程度4排除DNA分子的污染2.2RNA提取的注意事項2.2.1杜絕外源酶的污染一：嚴(yán)格戴好口罩，手套。二：實驗所涉及的離心管，Tip頭，移液器桿，電泳槽，實驗臺面等要徹底處理。三：實驗所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保RNase-Free。2.2.2阻止內(nèi)源酶的活性一：選擇合適的勻漿方法。二：選擇合適的裂解液。三：控制好樣品的起始量。2.3Rnase污染的10大來源1：手指頭2：槍頭3：水/緩沖液4：實驗臺面5：內(nèi)

5、源Rnase6：RNA樣品7：質(zhì)粒抽提8：RNA保存9：陽離子(Ca,Mg)10：后續(xù)實驗所用的酶2.4幾種RNA提取方法2.4.1TRIzol法TRIZOL試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細(xì)胞時能保持RNA的完整性。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。共純化DNA對于樣品間

6、標(biāo)準(zhǔn)化RNA的產(chǎn)量十分有用。TRIzol法提取流程1．樣品處理：（１）培養(yǎng)細(xì)胞：收獲細(xì)胞1-5×107，移入1.5ml離心管中，加入1mlTrizol，混勻，室溫靜置5min。（２）組織：取50-100mg組織（新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可）置1.5ml離心管中，加入1mlTrizol充分勻漿，室溫靜置５min。2．加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。3．4℃離心，12000g×15min，取上清。4．加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。5．4℃離心，12

7、000g×10min，棄上清。6．加入1ml75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4℃，7500g×5min，棄上清。7.晾干，加入適量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）。細(xì)胞基因組DNA水相有機相RNA氯仿純化pH5.7離心加入裂解液(TRNzol-A+)實驗流程圖細(xì)胞選擇貼壁細(xì)胞懸浮細(xì)胞2.4.2苯酚法細(xì)胞內(nèi)大部分RNA均與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA時要把RNA與蛋白質(zhì)分離并除去。將細(xì)胞置于含有十二烷基磺酸鈉（Sodiumdodecylsulfate,SDS）的緩沖液

8、中，加等體積水飽和酚，通過劇裂振蕩，然后離心形成上層水相和下層酚相。核酸溶于水相，被苯酚變性的蛋白質(zhì)或者溶于酚相，或者在兩相界面處形成凝膠層。苯酚法提取酵母RNA取1g活性干酵母在研缽中研碎，加10mLSDS-緩沖液使成勻漿，洗入各Eppendorf管（略少于管容積的一半），加溶菌酶0.1mL，混勻，室溫靜置10min，再加等體積飽和酚液，室溫下劇烈振蕩5min。置冰浴中分層，在0-4℃低溫環(huán)境下，10000r/min離心10min。吸出上