原代細胞培養(yǎng)與建系

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1、原代細胞的培養(yǎng)與建系??細胞的來源多樣，培養(yǎng)方法也各不相同，凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細胞稱之為原代細胞。原代細胞經(jīng)分散接種之手段稱為傳代。凡能經(jīng)傳代方式進行再次培養(yǎng)的細胞稱為傳代細胞。若能穩(wěn)定生長傳至10~20代以上的細胞可確立為細胞系。若有條件能開展單細胞克隆、純化，經(jīng)大量擴增后所形成的生物學(xué)特性穩(wěn)定的克隆化細胞群，稱之為細胞株或克隆細胞。此過程稱為細胞的純化或細胞克隆。這些基本技術(shù)是從事細胞培養(yǎng)工作的基礎(chǔ)，只有熟悉和掌握了基本技術(shù),才可能更快捷地學(xué)習(xí)和掌握其他方法,本章重點敘述常

2、用的基本技術(shù)。??第一節(jié)?原代細胞的取材??人和動物細胞的取材是原代細胞培養(yǎng)成功的首要條件，是進行細胞培養(yǎng)的第一步，若取材不當(dāng)，將會直接影響細胞的體外培養(yǎng)，現(xiàn)將取材的基本要求和注意事項敘述如下：??一、取材的基本要求??（1）取材要注意新鮮和保鮮?新鮮組織易于培養(yǎng)成功，取材時應(yīng)盡量在4~6h內(nèi)能制作成細胞，盡快入箱培養(yǎng)，若不能即時培養(yǎng)，應(yīng)將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)，于4℃存放。若組織塊較大，應(yīng)在清除表面血塊、壞死組織、脂肪和結(jié)締組織后，切碎于培養(yǎng)液內(nèi)4℃存放，但時間不能超過24h。對于已切碎的組織或血液、淋巴組織應(yīng)加入含10%二甲基

3、亞砜的培養(yǎng)基，按細胞凍存方式于液氮中冷凍保存。??（2）取材應(yīng)嚴格無菌?所取標(biāo)本材料應(yīng)在無菌條件下進行，為了確保無菌，對所取材料若疑有污染的可能，應(yīng)將所取組織在含高濃度抗菌素（400單位/mL）甚至加入適量的兩性霉素B或10%達克寧液的培養(yǎng)液內(nèi)于4℃下存放2小時以上，再用PBS洗2~3次，以確保所取材料無菌。要用無菌包裝的器皿或事先消毒好的帶少許培養(yǎng)液（內(nèi)含400單位/mL抗菌素）的小瓶等便于攜帶的物品來取材，所取材料應(yīng)避免接觸有毒有害的化學(xué)物質(zhì)，如碘、汞等。??（3）取材和原代細胞制作時，要用鋒利的器械，如手術(shù)刀或剃須刀片切

4、碎組織，盡可能減少對細胞的機械損傷。??（4）要仔細去除所取材料上的血液（血塊）、脂肪、壞死組織及結(jié)締組織，切碎組織時應(yīng)避免組織干燥，可在含少量培養(yǎng)液的器皿中進行。??（5）取材應(yīng)注意組織類型、分化程度、年齡等，一般來講，胚胎組織較成熟個體組織容易培養(yǎng)，分化低的較分化高的組織容易生長，腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。取材時應(yīng)盡量選用易培養(yǎng)的組織進行培養(yǎng)。??（6）原代細胞取材時要同時留好組織學(xué)標(biāo)本和電鏡標(biāo)本。對組織的來源、部位、包括供體的一般情況要做詳細的記錄，以備以后查詢。??二、各類組織的取材技術(shù)??(一)?皮膚和粘膜的取材?

5、?皮膚和粘膜是上皮細胞培養(yǎng)的重要組織來源，主要取自于手術(shù)過程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術(shù)操作，但面積一般2~4cm2即可，這樣局部不留疤痕，若對燒傷皮膚進行上皮細胞膜片移植，可從大腿或臀部取較大皮片，可取2~4cm2皮片，但取材時不要用碘酒消毒；若培養(yǎng)上皮細胞，取材時不要切取太厚，盡可能去除所攜帶的皮下或粘膜下組織；若欲培養(yǎng)成纖維細胞，則反之。皮膚粘膜與外界相通部位，因表面細菌、霉菌很多，取材時應(yīng)嚴格消毒，必要時要用高濃度抗菌素和適量兩性霉素B漂洗、浸泡。??(二)內(nèi)臟和實體瘤的取材??內(nèi)臟除消化道外基本是無菌的，但取材

6、時要明確和熟悉所需組織的類型和部位，實體瘤取材時要取腫瘤細胞豐富的區(qū)域，要避開破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結(jié)締組織，否則培養(yǎng)后，由于成纖維細胞的生長給以后的培養(yǎng)工作增加困難。對于一些特殊細胞培養(yǎng)的取材，詳見后面有關(guān)章節(jié)。??(三)血液細胞的取材??血液及淋巴組織中的血細胞、淋巴細胞的取材，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中（如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結(jié)等）分離細胞，取材時應(yīng)注意抗凝，通常采用肝素抗凝，常用肝素濃度為8~10u/mL血，抽血的針筒也要用肝素濕潤，若從血站取來的獻血員的血液，因血站不用肝素抗凝劑，常

7、用含枸椽酸鹽抗凝，對此類血標(biāo)本千萬不能用含鈣、鎂離子的洗液來處理細胞，因此時的鈣、鎂離子可加速血液中凝血酶促進血液凝固而影響收獲血細胞及淋巴細胞。此外要嚴格無菌，盡量新鮮使用。??(四)骨髓、羊水、胸/腹水細胞取材??取上述標(biāo)本時，除嚴格無菌，注意抗凝外，還要盡快分離培養(yǎng)，一般無需其他處理，離心后，用無鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng)，不宜低溫存放。具體操作詳見后面有關(guān)章節(jié)。??(五)動物組織取材??1、鼠胚組織取材??首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動物，然后將其整個浸泡在含有75%酒精的燒杯中，5分鐘

8、后（注意時間不能太長，以避免酒精從口或其他通道進入體內(nèi)，影響組織活力），取出動物，在消毒過的木板上可用無菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開皮膚，用無菌操作法解剖取胚或用無菌止血鉗挾起皮膚、用無菌眼科剪沿軀干中部環(huán)形剪開皮膚，用止血鉗分別挾住兩側(cè)皮膚拉向頭尾，把動物反包，暴露軀干，