sirnaid1對人肝癌細胞hepg2中er

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1、siRNAID1對人肝癌細胞HepG2中ER【摘要】目的觀察siRNAID1轉(zhuǎn)染人肝癌細胞HepG2細胞后對肝癌細胞系HepG2細胞增殖的影響及其對ERK1/2通路的作用。方法實驗分為4組，即空白對照組、轉(zhuǎn)染試劑組、轉(zhuǎn)染對照組及轉(zhuǎn)染siRNAID1組。陽離子脂質(zhì)體法介導(dǎo)siID1轉(zhuǎn)染肝癌細胞后，唑藍比色法(MTT)觀察HepG2細胞增殖情況。分別用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)法(RTPCR)和蛋白免疫印跡法(AP激酶類;肝腫瘤;轉(zhuǎn)染;信號傳導(dǎo);氮藍四唑;RNA，小分子干擾近期發(fā)現(xiàn)，絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedprot

2、einkinase,MAPK)信號途徑的激活可能是DNA結(jié)合抑制因子1(inhibitorofdifferentiation/DNAbinding1,IDl)誘導(dǎo)細胞增殖的一個機制[1]。與正常組織相比較，肝癌組織中的MAPK通路上的細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinase,ERK)都是處于高表達及高活性狀態(tài)。若使用其ERK抑制劑就可以減緩細胞的增殖及引起細胞的凋亡[2]。本研究通過小分子干擾RNA技術(shù)使ID1基因沉默，觀察其對HepG2細胞增殖的影響及其對ERK1/2mRNA及蛋白表達的影響

3、，探討ERK1/2及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系?！　?材料和方法　　1.1材料人肝癌細胞株HepG2細胞(上?？茖W(xué)院細胞中心);siRNA試劑(廣州銳博生物有限公司);四甲基偶氮唑藍(MTT，廈門泰京生物有限公司);逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)試劑盒(美國Fermentas公司);PCR引物由上海鼎安生物科技有限公司合成;兔抗人ERK1/2多克隆抗體，兔抗人pERK1/2多克隆抗體，辣根過氧化酶(HRP)標記的羊抗兔IgG(美國SantaCruz公司)。　　1.2分組分為4組，即空白對照組(正常培養(yǎng)HepG2細胞組);轉(zhuǎn)染試劑組(

4、即僅加入Lipofectamine2000組;轉(zhuǎn)染對照組(即轉(zhuǎn)染非特異性序列controlsiRNA組);轉(zhuǎn)染siRNAID1組。　　1.3方法　　1.3.1siRNA的設(shè)計和合成siRNAID1由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計合成。　　靶序列：5’TGAGCAAGGTGGAGATTCT3’　　正義鏈：5’UGAGCAAGGUGGAGAUUCUdTdT3’　　反義鏈：3’dTdTACUCGUUCCACCUCUAAGA5’　　1.3.2細胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃、體積分

5、數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(無抗生素)將消化后的HepG2細胞制備成細胞懸液;調(diào)整細胞濃度為1×107L-1，接種于細胞培養(yǎng)板內(nèi)(6孔加入2mL，每孔2×104細胞)，培養(yǎng)24h。參照說明書建議，將siRNA濃度稀釋為50nmmol/L，陽離子脂質(zhì)體法介導(dǎo)siRNAID1轉(zhuǎn)染肝癌細胞。存放24h后備檢測?！　?.3.3MTT法測定細胞增殖將對數(shù)生長期細胞接種于96孔板，每組設(shè)4個復(fù)孔，分別于培養(yǎng)24，48，72，96h后;每孔加入20μLMTT(5g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄去上清

6、，每孔加二甲基亞砜(DMSO)150μL，平板搖床震搖10min，酶聯(lián)免疫檢測儀測定490nm處的吸光度(OD值)。　　細胞增殖抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值　　1.3.4RTPCR檢測ERK1/2及pERK1/2mRNA的表達水平用Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。(1)內(nèi)對照β肌動蛋白(βactin)，擴增片段556bp;循環(huán)條件：4℃預(yù)變性5min，擴增94℃30s→57℃30s→72℃45s，30個循環(huán)，最終延伸72℃7min?！　∩嫌危?’AAAGACCTGTACGCCAACACAG3’　

7、　下游：5’TTTTAGGATGGCAAGGGACTTC3’　　(2)ERK1/2擴增片段320bp;循環(huán)條件：預(yù)變性5min，擴增94℃30s→59℃30s→72℃30s，30個循環(huán)，最終延伸72℃7min?！　∩嫌危?’TACACGCAGTTGCAGTACATCG3’　　下游：5’CGCAGGATCTGGTAGAGGAAGT3’　　(3)pERK1/2擴增片段248bp;循環(huán)條件：94℃預(yù)變性5min，擴增94℃30s→55℃30s→72℃30s，30個循環(huán)，最終延伸72℃7min。　　上游：5’GGAGCTTGTGGAAATAC

8、CTTGG3’　　下游：5’GACGCAGTGTTCCTCTCTGCTA3’　　PCR擴增產(chǎn)物用凝膠圖