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1、桂枝對(duì)MRL小鼠心肌細(xì)胞凋亡及Caspase3基因表達(dá)的影響【摘要】目的探討中藥桂枝對(duì)MRL小鼠心肌細(xì)胞凋亡的作用及對(duì)Caspase3基因表達(dá)的影響。方法將MRL小鼠分為空白組、強(qiáng)的松組和桂枝組，檢測(cè)MRL小鼠心肌組織凋亡細(xì)胞，計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI），ＲＴ-ＰＣＲ法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡基因Caspase3表達(dá)，觀察桂枝對(duì)MRL小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果桂枝能調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡基因Caspase3表達(dá)，即抑制Caspase3表達(dá)，明顯抑制心肌細(xì)胞凋亡(心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著下降)。其療效明顯優(yōu)于空白組（P<0.05），有顯著性差異，與強(qiáng)的松組療效相
2、當(dāng)（P>0.05）。結(jié)論桂枝可能通過(guò)調(diào)控凋亡基因而抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而延緩或部分逆轉(zhuǎn)MRL心肌損害的發(fā)生、發(fā)展?！娟P(guān)鍵詞】MRL小鼠；細(xì)胞凋亡；Caspase3基因表達(dá)系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemiclupuserythematosus,SLE）是一種多因素參與的累及全身多臟器、多系統(tǒng)的自身免疫性疾病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采用腎上腺糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、非甾體抗炎藥等治療，但有明顯的副作用，停藥后病情也易反復(fù)，治療現(xiàn)狀不容樂(lè)觀。目前在中醫(yī)中藥領(lǐng)域內(nèi)尋找治療SLE及SLE心肌損害的有效藥物，并從調(diào)控凋亡基因、抑制細(xì)胞凋亡切入研究其作用機(jī)理，是一項(xiàng)很有裨益
3、的探索。本實(shí)驗(yàn)對(duì)MRL小鼠應(yīng)用桂枝進(jìn)行了該方面的探討?！ ?材料與儀器 1.1動(dòng)物 8～10周齡雌性MRL小鼠，體質(zhì)量20～25g，由上海動(dòng)物中心提供。 1.2藥品桂枝藥物由河北工程大學(xué)附屬教學(xué)中醫(yī)院提供，強(qiáng)的松片由浙江仙居制藥廠(chǎng)生產(chǎn)。 1.3試劑RNA提取試劑TrizolReagent購(gòu)自華美生物工程公司，為Invitrogen公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄酶（AMV-RT），核糖核酸酶抑制劑（RNasin），dNTP，TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase），隨機(jī)引物（Randomprimers），瓊脂糖（agarose）均購(gòu)自美國(guó)Prom
4、ega公司?！ ?.4儀器756型紫外分光光度計(jì)為上海精密儀器廠(chǎng)生產(chǎn)；GeneAmp9600型PCR儀為美國(guó)PE公司生產(chǎn)；RS-28高速低溫離心機(jī)為德國(guó)賀利氏公司生產(chǎn)；超低溫冰箱為德國(guó)賀利氏公司生產(chǎn)；UVP凝膠掃描系統(tǒng)由美國(guó)UVP公司生產(chǎn)；微量移液器為德國(guó)Gilson公司生產(chǎn)；DYZ-22A型雙恒定時(shí)電泳儀為北京市六一儀器廠(chǎng)生產(chǎn)；DYY-Ⅲ橋式電泳儀為北京市六一儀器廠(chǎng)生產(chǎn)。 2方法 2.1實(shí)驗(yàn)分組與給藥36只雌性MRL小鼠，隨機(jī)分為3組，即空白對(duì)照組，強(qiáng)的松組，桂枝組，各12只。空白對(duì)照組給予生理鹽水灌胃1ml/d，強(qiáng)的松組給予強(qiáng)的松混懸液灌胃0.
5、02g·ml-1·d-1，桂枝組給予桂枝煎劑0.12g·ml-1·d-1，分兩次給予，各組灌胃3周后處死動(dòng)物，取心室肌組織?！ ?.2檢測(cè)指標(biāo)與方法 2.2.1心肌細(xì)胞凋亡Ladder電泳用堿裂解法提取心?。停模?洗滌,ＴＥ過(guò)夜溶解。制備15%的瓊脂糖凝膠，加入DNA樣品，以5V/cm的電壓電泳1～2ｈ，紫外透射儀觀察DNA條帶，成像、照片?！ ?.2.2凋亡及相關(guān)基因檢測(cè)迅速分離心臟,常規(guī)石蠟包埋，切片數(shù)張。心肌細(xì)胞凋亡按末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT酶)介導(dǎo)的帶熒光的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)標(biāo)記凋亡細(xì)胞核的3’末端。分離MRL小鼠心臟，
6、使用200℃干烤的器械于手術(shù)臺(tái)上留取100mg心室肌組織，迅速將組織置于4℃DEPC水中洗去血液后，置凍存管中保存于液氮中，M-Caspase3基因按照相應(yīng)的RT-PCR實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行檢測(cè)，引物序列依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)，由上海生物工程公司合成，RT-PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠（含GoldViein，用UVP凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝打印實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用凝膠圖像分析系統(tǒng)（Gel-ProAnalyzerVersion3.0）分析結(jié)果。 2.3圖像分析用圖像分析儀900倍放大凋亡和免疫組化切片，每張片隨機(jī)取10個(gè)視野，測(cè)定陽(yáng)性染色的平均吸光度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比，計(jì)算細(xì)胞凋亡
7、指數(shù)(AI)。 2.4統(tǒng)計(jì)方法所有數(shù)據(jù)用SPSS11.5軟件處理。數(shù)據(jù)以±ｓ表示。多組間比較用方差分析,兩兩比較用ｑ檢驗(yàn),率檢驗(yàn)用χ2分析。 3結(jié)果 3.1桂枝對(duì)MRL小鼠心肌組織DNA凋亡Ladder發(fā)生率的影響空白對(duì)照組MRL小鼠通過(guò)DNA瓊脂糖電泳可見(jiàn)凋亡Ladder的發(fā)生率明顯較其它組高。桂枝組和強(qiáng)的松組心肌細(xì)胞凋亡Ladder的發(fā)生率明顯下降，兩組與空白對(duì)照組相比經(jīng)χ2檢驗(yàn)，Ｐ<001，差異有顯著性。見(jiàn)表1。表1各組小鼠心肌細(xì)胞DNA凋亡Ladder發(fā)生率的比較（略） 3.2桂枝對(duì)心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的影響空白對(duì)照組MRL
8、小鼠凋亡指數(shù)和M-Caspase3基因表達(dá)較高，與之相比，桂枝組和強(qiáng)的松組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)和
