rna介導(dǎo)abce1基因沉默對(duì)肺癌細(xì)胞95d增殖

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1、RNA介導(dǎo)ABCE1基因沉默對(duì)肺癌細(xì)胞95D增殖【摘要】目的研究構(gòu)建的ABCE1基因SiRNA表達(dá)質(zhì)?；虺聊Ч?，及其對(duì)95D肺癌細(xì)胞株增殖、凋亡能力的影響。方法運(yùn)用轉(zhuǎn)染試劑FuGENE6對(duì)3種不同的ABCE1基因SiRNA表達(dá)質(zhì)粒在95D肺癌細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并用G418篩選，熒光顯微鏡觀察3種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效果，收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞總數(shù)、運(yùn)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果①轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)紅色熒光蛋白，熒光顯微鏡結(jié)果表明,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率達(dá)42.7%。②實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖低于對(duì)照組、而細(xì)胞凋亡高于對(duì)照組(P＜0.05)。結(jié)論ABC

2、E1特異性siRNA可明顯抑制ABCE1基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá),并能有效誘導(dǎo)95D細(xì)胞的凋亡,為下一步在體內(nèi)利用Si1重組質(zhì)粒沉寂ABCE1基因,促腫瘤細(xì)胞的凋亡提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】SiRNA；ABCE1基因；轉(zhuǎn)染第一：鄭毛根(1966)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要研究肺癌的早期診斷與治療。ABCE1基因是保守的ABC基因家族中最保守的基因之一，Chen等最近報(bào)道，ABCE1基因在脊椎動(dòng)物的翻譯起始中起重要作用，而翻譯作為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起相當(dāng)重要的作用〔1〕。近期發(fā)展起來(lái)的RNA干擾技術(shù)具有幾乎無(wú)細(xì)胞毒性、穩(wěn)定性強(qiáng)、高效特異抑制靶基因等特點(diǎn)，為特異地

3、抑制目的基因表達(dá)提供了有效的方法。本實(shí)驗(yàn)擬利用ABCE1特異性SiRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞系95D，評(píng)價(jià)其對(duì)95D細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，并評(píng)價(jià)其對(duì)增殖、凋亡相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達(dá)的影響，推測(cè)ABCE1基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞95D的轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)能力，為利用研究ABCE1與肺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！　?材料與方法　　1.1材料　　人肺腺癌細(xì)胞株95D購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。3種ABCE1基因的SiRNA質(zhì)粒(Si1,Si2,SiN)均為本課題組前期實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建。1640培養(yǎng)基、10%胎生小牛血清購(gòu)于Hyclone公司。G418(GibcoBRL)購(gòu)自北京中山

4、生物工程公司；轉(zhuǎn)染試劑FUGENE6和ELISA試劑盒購(gòu)自Roche公司(USA)，MTT購(gòu)自Sigma公司(USA)。細(xì)胞培養(yǎng)板6孔板、24孔板、96孔板購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司?！　?.2方法　　1.2.1NSCLC細(xì)胞株培養(yǎng)　　凍存細(xì)胞95D經(jīng)復(fù)蘇后，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基(含濃度為100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素中，待80～90%細(xì)胞融合后胰酶消化傳代。經(jīng)3次傳代穩(wěn)定后，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)?！　?.2.2G418篩選濃度確定　　在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，95D細(xì)胞,按1.5×105/孔細(xì)胞接種，加10

5、%FBS的1640培養(yǎng)基1ml培養(yǎng)，至細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%左右，分別加入G418(新霉素)，使G418篩選濃度依次為將每孔中的G418濃度稀釋至50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100μg/ml等12個(gè)級(jí)別，培養(yǎng)10～14d。每3天換液1次，維持培養(yǎng)孔中G418篩選濃度不變，顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，以第8～14天能殺死孔內(nèi)所有細(xì)胞的G418濃度確定為篩選濃度?！　?.2.3細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染　　將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞按2×103濃度接種到6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。于30%～50%細(xì)胞匯合度時(shí)(處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)準(zhǔn)備進(jìn)

6、行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為4組，分別為質(zhì)粒Si1轉(zhuǎn)染組、質(zhì)粒Si2轉(zhuǎn)染組、陰性序列轉(zhuǎn)染組(質(zhì)粒SiN組)及空白對(duì)照組(正常細(xì)胞N組)。轉(zhuǎn)染按Roche公司非脂質(zhì)體型轉(zhuǎn)染試劑FuGENE6說(shuō)明書操作。前3組內(nèi)質(zhì)粒與FuGENE6采用1∶6比例。48h后用含有600μg/mlG418的10%FBS培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基，每2天更換一次，至轉(zhuǎn)染后5d。用倒置熒光顯微鏡(IX71,Olympus)和圖像分析系統(tǒng)(SPOTRFKE,USA)，直接觀察基因沉默的效果?！　?.2.4TT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況(按說(shuō)明書操作)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔490nm吸光值(A)?！　?.2.6組

7、蛋白DNAELISA凋亡檢測(cè)　　收集轉(zhuǎn)染后72、96、120h的上述三組細(xì)胞，按細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，盡快作比色分析(10～20min內(nèi))，用底物緩沖液作空白對(duì)照，以波長(zhǎng)405nm，參考波長(zhǎng)492nm進(jìn)行檢測(cè)?！　?.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析　　數(shù)據(jù)以x±s表示，以SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用方差分析作差異的顯著性分析?！　?結(jié)果　　2.1ABCE1SiRNA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染的效果　　根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道RNAiReadypSIRENDNRDsRedExpress載體在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中可直接用來(lái)觀察構(gòu)建的shRNA的對(duì)目的基因封閉的效能，該質(zhì)粒載體能表達(dá)一種在熒光顯微

8、鏡下可觀察到紅色熒光蛋白〔2〕。顯示在