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《皂角皂苷對smmc7721細胞caspase3表達的影響》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、皂角皂苷對SMMC7721細胞Caspase3表達的影響【關鍵詞】SMMC7721細胞;凋亡;Caspase3;皂角皂苷細胞凋亡的機制中,凋亡的細胞因子受體信號轉(zhuǎn)導途徑一直被人們所關注,尤其是細胞內(nèi)蛋白水解酶(cysteinylaspartatespecificproteases,Caspase)〔1〕。Caspase是目前公認的細胞凋亡后期的共同途徑。本實驗以SMMC7721細胞株為研究對象,利用特殊工藝從皂角皂苷中提取有效部位,通過檢測細胞的生存率及Caspase3的表達,探討皂角皂苷對SMMC77
2、21細胞的誘導凋亡作用?! ?材料與方法 1.1材料SMMC7721細胞株細胞由吉林大學第一醫(yī)院提供。阿霉素、DAB購于Sigma,皂角皂苷由長春中醫(yī)學院贈予,IMDM培養(yǎng)基和新生牛血清購于Hyclone,Trizol試劑購于Invitrogen,Caspase3引物和PCR試劑購于Takara?! ?.2SMMC7721細胞培養(yǎng)SMMC7721細胞置于完全培養(yǎng)基(10%Hyclone新生牛血清,IMDM培養(yǎng)液pH7.4)中,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞在無阿霉素的條件下培養(yǎng)1l?! ?.3亞甲基四唑
3、藍(Methylthiazolyltetrazolium,MTT)測定細胞生存率取對數(shù)生長期的SMMC7721細胞。消化、離心,使成單細胞懸液,計數(shù),以細胞數(shù)1.0×104/孔接種于96孔板中。24h后,加入不同濃度的藥物,單獨應用阿霉素5μg/ml及阿霉素5μg/ml分別與皂角皂苷50、100μg/ml聯(lián)合應用。24h后,每孔加入0.5mg/ml的MTT液20μl,4h后棄掉培養(yǎng)液,每孔加150μlDMSO,570nm測其吸光度值。實驗重復5次?! ?.4SMMC7721細胞Caspase3mRNA的表達同劑量
4、藥物作用24h,SMMC7721細胞中總RNA提取參照UltraspecTMIIRNAIsolationSystem(BiotecxLaboratories,INC)說明書進行,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板,進行PCR反應。GAPDH引物序列為正義:5′GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT3′,反義:5′AAGAATGGGTGTTGCTGTTGAAGTC3′,片段大小700bp。Caspase3引物序列為正義:5′TTTGTTTGTGTGCTTCTGAGCC3′,反義:5′ATT
5、CTGTTGCCACCTTTCGG3′,片段大小400bp。PCR反應條件:變性94℃,30s,退火59℃,30s,延伸72℃,45s。Caspase3為28個循環(huán),GAPDH為25個循環(huán)。取PCR產(chǎn)物進行電泳,凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。實驗重復3次。 1.5統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)均以x±s表示,用SPSS11.0軟件進行多組間ANOVA分析?! ?結果 2.1阿霉素和皂角皂苷對SMMC7721細胞生存率的影響阿霉素(5μg/ml)單獨作用于SMMC7721細胞時,細胞存活率(80%)與對照組(90%)比較無明顯變
6、化。皂角皂苷(50、100μg/ml)單獨作用于SMMC7721細胞時,細胞存活率也無明顯變化。當阿霉素和皂角皂苷聯(lián)合作用于SMMC7721細胞時,阿霉素5μg/ml+皂角皂苷50μg/ml組(52%)、阿霉素5μg/ml+皂角皂苷100μg/ml組(42%)與對照組或阿霉素組比較,細胞存活率明顯下降(P<0.01)。 2.2阿霉素和不同濃度皂角皂苷作用SMMC7721細胞Caspase3mRNA表達RTPCR結果表明:阿霉素單獨作用SMMC7721細胞時,與對照組相比Caspase3mRNA表達
7、未見明顯差異;阿霉素和不同濃度皂角皂苷共同作用時,與對照組和阿霉素單獨作用時相比Caspase3mRNA表達明顯增高(圖1)?! ?.對照組;2.阿霉素5μg/ml;3.阿霉素5μg/ml+皂角皂苷50μg/ml;4.阿霉素5μg/ml+皂角皂苷100μg/ml 圖1阿霉素和不同濃度皂角皂苷作用下 SMMC7721細胞Bcl2mRNA表達 Caspase3處于細胞凋亡的下游,細胞凋亡有細胞外和細胞內(nèi)兩條經(jīng)典的途徑。在細胞外途徑中,死亡信號的傳導靠死亡配體與受體的結合來展開,接著死亡受體的死亡結構域與信號傳
8、導分子結合,信號傳導分子又與Caspase8酶原相連接,激活Caspase8使線粒體釋放細胞色素C,或直接作用于Caspase3及其他下游的Caspase。在細胞內(nèi)途徑中,細胞內(nèi)的死亡信號,例如DNA損傷、毒素和ATP耗竭等均可誘發(fā)線粒體釋放細胞色素C,激活Caspase3降解底物使細胞凋亡〔3~6〕?! 嶒灲Y果顯示:阿