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《堆肥中高效纖維素降解菌的篩選與鑒定》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、堆肥中高效纖維素降解菌的篩選與鑒定李丹花，喬莉娟，岳丹，昝立峰，段保寧，白蘭所（邯鄲學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河北邯鄲０５６００５）摘要：從邯鄲地區(qū)堆肥中分離出５株具有纖維素降解能力的菌株，纖維素降解能力的初步鑒定結(jié)果顯示，Ｍ１菌株具有較強(qiáng)的纖維素降解能力。對(duì)Ｍ１菌株進(jìn)行分子鑒定和生長(zhǎng)特性的初步鑒定，結(jié)果表明，Ｍ１菌株應(yīng)當(dāng)歸屬于假單胞菌屬（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．），菌株的溫度生長(zhǎng)范圍為１０～４５°Ｃ，最適生長(zhǎng)溫度為３０°Ｃ，ｐＨ６～８菌株均可生長(zhǎng)，最適條件為ｐＨ６。.jyqkL，加入玻璃珠振蕩培養(yǎng)１ｈ備用。１．２培養(yǎng)基配方羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基組分為：ＣＭＣ－Ｎａ１
2、０．００ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１．００ｇ、ＮａＣｌ０．１０ｇ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．３０ｇ、ＮａＮＯ３２．５０ｇ、ＦｅＣｌ３０．０１ｇ、ＣａＣｌ２０．１０ｇ、瓊脂１８．００ｇ、蒸餾水１Ｌ；剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基組分為：ＣＭＣ－Ｎａ１０．００ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１．００ｇ、ＮａＣｌ０．１０ｇ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．３０ｇ、ＮａＮＯ３２．５０ｇ、ＦｅＣｌ３０．０１ｇ、ＣａＣｌ２０．１０ｇ、剛果紅０．２０ｇ、瓊脂１８．００ｇ、蒸餾水１Ｌ；ＬＢ培養(yǎng)基組分：蛋白胨１０ｇ，酵母提取物５ｇ，ＮａＣｌ１０ｇ，瓊脂１５ｇ，蒸餾水１Ｌ，ｐＨ７．０。所有培養(yǎng)基于１２１℃下滅菌３０ｍｉｎ備用。１．
3、３菌種的分離純化發(fā)酵物菌液按照梯度稀釋法稀釋?zhuān)∠♂尪葹椋保埃病保埃档膽覞嵋海玻埃唉蹋谭謩e涂布于羧甲基纖維素鈉分離培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)物放入２８℃恒溫箱培養(yǎng)，將長(zhǎng)出的菌落接種至ＬＢ培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線(xiàn)純化。１．４分解纖維素能力鑒定將純化好的菌株點(diǎn)接到剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基上，２８℃恒溫箱培養(yǎng)５ｄ，量取透明圈直徑（Ｄ）和菌圈直徑（ｄ），并計(jì)算出比值HC（D/d）,從而判定菌株的纖維素分解能力。１．５菌株的分子鑒定用細(xì)菌ＤＮＡ提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取細(xì)菌基因組ＤＮＡ，以基因組ＤＮＡ為模板，２７Ｆ和１４９２Ｒ為１６ＳｒＤＮＡ引物進(jìn)行分子鑒定。ＰＣＲ產(chǎn)物瓊脂糖
4、凝膠回收試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）回收大約１．５ｋｂ的目的條帶，連接到ｐＧＭ－Ｔ載體（北京索萊寶科技有限公司）上，轉(zhuǎn)化至Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α感受態(tài)細(xì)胞中，將陽(yáng)性重組子送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)定得到的１６ＳｒＤＮＡ序列通過(guò)ＢＬＡＳＴ軟件與ＧｅｎＢａｎｋ中相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)，并利用ＭＥＧＡ５．０軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。１．６不同溫度對(duì)菌株Ｍ１生長(zhǎng)的影響將Ｍ１菌株的菌液以１％的接種量接種于５ｍＬＬＢ培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)于１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５和６０℃系列搖床內(nèi)，搖床轉(zhuǎn)速為１００ｒ/ｍｉｎ，２ｄ后測(cè)定菌株的生長(zhǎng)量。每個(gè)
5、處理重復(fù)３次。１．７不同ｐＨ對(duì)菌株Ｍ１生長(zhǎng)的影響將Ｍ１菌株的菌液以１％的接種量分別接種于ｐＨ２．０、４．０、６．０和８．０的５ｍＬＬＢ培養(yǎng)基中，置于３０℃、１００ｒ／ｍｉｎ的搖床上培養(yǎng)，２ｄ后測(cè)定菌株的生長(zhǎng)量。每個(gè)處理重復(fù)３次。２結(jié)果與分析２．１菌株分解纖維素能力鑒定腐熟發(fā)酵物樣品經(jīng)羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基分離培養(yǎng)和ＬＢ培養(yǎng)基劃線(xiàn)純化培養(yǎng)后共得到５株形態(tài)不同的菌株，分別命名為Ｍ１－Ｍ５。５株菌都可以在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，具有降解纖維素的能力。同時(shí)測(cè)定菌株在剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)的ＨＣ值（Ｄ/ｄ），對(duì)篩選到的菌種進(jìn)行分解纖維素能力的初步鑒定，結(jié)果如表１所示。
6、Ｍ１－Ｍ５菌株的ＨＣ值表明，Ｍ１菌株的ＨＣ值最高。前人研究表明［４］，ＨＣ值超過(guò)２．５０的菌株纖維素酶活性高，Ｍ１菌株的ＨＣ值為２．５０，具有較強(qiáng)的纖維素降解能力。２．２菌株鑒定結(jié)果將菌株Ｍ１的１６ＳｒＤＮＡ測(cè)序結(jié)果用ＢＬＡＳＴ軟件進(jìn)行同源性比較，菌株Ｍ１的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖１所示。結(jié)果表明，Ｍ１菌株序列與多個(gè)假單胞菌屬（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）菌株的１６ＳｒＤＮＡ序列相似性都達(dá)到９９％，與Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．ＪＣ５菌株處在同一個(gè)分支上，因此，將菌株Ｍ１歸屬于Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．。２．３Ｍ１菌株生長(zhǎng)特性Ｍ１菌株生長(zhǎng)特性如圖２所示，由圖２可知，菌株的溫
7、度生長(zhǎng)范圍為１０～４５℃，最適生長(zhǎng)溫度在３０℃左右，當(dāng)溫度高于４５℃時(shí)，菌株幾乎不能生長(zhǎng)。ｐＨ６～８條件下菌株均可生長(zhǎng)，最適條件為ｐＨ６，ｐＨ＜４或ｐＨ＞１０，菌株均不能生長(zhǎng)。３小結(jié)與討論本試驗(yàn)從腐熟堆肥發(fā)酵物中篩選到５株形態(tài)不同的菌株。分別命名為Ｍ１－Ｍ５。５株菌都可以在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，具有降解纖維素的能力。同時(shí)測(cè)定菌株在剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)的ＨＣ值，Ｍ１菌株的ＨＣ值最高（２．５０），具有較強(qiáng)的纖維素降解能力。對(duì)菌株Ｍ１進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果表明，Ｍ１菌株序列與多個(gè)假單胞菌屬菌株的１６ＳｒＤＮＡ序列相似性都達(dá)到９９％，與Ｐｓｅｕｄ
